Estudi de la presència de biomarcadors d’infertilitat masculina

Abstract

De manera rutinària, el diagnòstic inicial de la infertilitat masculina es realitza mitjançant l’estudi macroscòpic i microscòpic de la mostra de semen. Aquests proporcionen informació rellevant sobre el recompte, la mobilitat i la morfologia dels espermatozoides, però no sobre el potencial de fertilització de la mostra, sovint aquests paràmetres tenen un valor pronòstic limitat en processos de fecundació natural i/o artificial. A més, alguns estudis determinen que hi ha pacients que es poden diagnosticar erròniament com a idiopàtics, ja que hi ha certes anomalies a nivell molecular o genètic que no són detectables en el seminograma. Per abordar aquest problema, és necessari estudiar nous biomarcadors que permetin entendre els mecanismes moleculars implicats en la infertilitat. Per a això, en aquest treball s’han utilitzat tècniques proteòmiques d’expressió diferencial tant en mostres de plasma seminal com d’espermatozoides. En el primer estudi, s’ha demostrat la presència d’activitat nucleasa en el líquid seminal de diferents grups de pacients, inclosos aquells que no presenten espermatozoides, amb azoospermia. A més, s’ha observat un increment de l’activitat nucleasa per espermatozoide en aquells grups que tenen més paràmetres del seminograma alterats, així com una correlació entre l’activitat nucleasa i la fragmentació de l’ADN dels espermatozoides valorada amb Comet alcalí, la morfologia i la mobilitat espermàtica. Per últim, mitjançant la corba ROC s’ha comprovat que l’activitat nucleasa és una bona variable per predir la infertilitat masculina. En el segon estudi, s’ha comparat el perfil proteic del líquid seminal de controls fèrtils amb pacients seleccionats segons el seminograma, patologia i valors d’integritat de l’ADN dels espermatozoides mitjançant Comet neutre, alcalí i SCD. Les 24 mostres analitzades s’han classificat en 4 grups diferents: controls fèrtils, avortaments de repetició, astenoteratozoospèrmics i astenoteratozoospèrmics amb varicocele. L’anàlisi proteòmica comparativa s’ha realitzat mitjançant la tecnologia 2D-DIGE i ha revelat la presència de 28 proteïnes diferencials. Aquestes estan involucrades en processos metabòlics i cel·lulars, funcions catalítiques i es troben al component extracel·lular. L’anàlisi de les interaccions entre proteïnes ha mostrat que estan associades entre elles i també amb la Ubiquitina C, indicant que la regulació d’aquestes proteïnes té un paper important en la infertilitat masculina. En el tercer estudi, s’ha comparat el perfil proteic dels espermatozoides de mostres de controls fèrtils amb avortaments de repetició abans i després d’un tractament oral amb antioxidants mitjançant el marcatge isobàric TMT. S’han identificat 34 proteïnes amb expressió diferencial entre els grups d’avortaments de repetició i controls fèrtils, a més algunes proteïnes milloren el seu perfil d’expressió després del tractament amb antioxidants, indicant que són vulnerables a l’estrès oxidatiu. No obstant, no hi ha diferències significatives entre els avortaments de repetició abans i després del tractament amb antioxidant, per tant, la patologia espermàtica produïda en aquests pacients no és deguda principalment a l’estrès oxidatiu. Finalment, l’anàlisi d’interaccions entre les proteïnes diferencials ha mostrat tres vies principals d’afectació: metabolisme, citoesquelet i dany en l’ADN dels espermatozoides. En conjunt, els resultats obtinguts demostren la importància de l’estudi de proteïnes que s’expressen de manera diferencial entre individus fèrtils i infèrtils ja que permet aprofundir en el coneixement dels mecanismes moleculars implicats en la infertilitat masculina i personalitzar el diagnòstic de pacients amb la construcció de nous panells de biomarcadors.

De manera rutinaria, el diagnóstico inicial de la infertilidad masculina se realiza mediante el estudio macroscópico y microscópico de la muestra de semen. Estos proporcionan información relevante sobre el recuento, la movilidad y la morfología de los espermatozoides, pero no sobre el potencial de fertilización de la muestra, a menudo estos parámetros tienen un valor pronóstico limitado en procesos de fecundación natural y/o artificial. Además, algunos estudios determinan que hay casos de infertilidad masculina que se pueden diagnosticar erróneamente como idiopáticos, ya que hay ciertas anomalías a nivel molecular o genético que no presentan manifestaciones detectables con el seminograma. Para abordar este problema, es necesario obtener nuevos biomarcadores que ayuden a entender los mecanismos moleculares implicados en la fecundación. Para ello, en este trabajo se han utilizado técnicas proteómicas de expresión diferencial tanto en muestras de plasma seminal como de espermatozoides.

En el primer estudio, se ha demostrado la presencia de actividad nucleasa en el líquido seminal de diferentes grupos de pacientes incluidos aquellos que no presentan espermatozoides, con azoospermia. Además, se ha observado un incremento de la actividad nucleasa por espermatozoide en aquellos grupos que tienen más parámetros del seminograma alterados, así como una correlación entre ésta y la fragmentación de cadena sencilla del ADN de los espermatozoides, la morfología y la movilidad espermática. Por último, mediante la curva ROC se ha comprobado que la actividad nucleasa es una buena variable para predecir la infertilidad masculina. En el segundo estudio, se ha comparado el perfil proteico del líquido seminal de controles fértiles con pacientes seleccionados según su seminograma, patología y valores de integridad del ADN de los espermatozoides mediante Comet neutro, alcalino y SCD. Las 24 muestras analizadas se han clasificado en 4 grupos diferentes: controles fértiles, abortos de repetición, astenoteratozoospérmicos, astenoteratozoospérmicos con varicocele. El análisis proteómico comparativo se ha realizado mediante el sistema de electroforesis en gel bidimensional basado en el marcaje fluorescente (2D-DIGE) y ha revelado la presencia de 28 proteínas diferenciales. Éstas están involucradas en procesos metabólicos y celulares, funciones catalíticas y se encuentran en el componente extracelular. El análisis de las interacciones entre proteínas ha mostrado que están asociadas entre ellas y también con la ubiquitina C, indicando que la regulación de estas proteínas tiene un papel importante en la infertilidad masculina. En el tercer estudio, se ha comparado el perfil proteico de los espermatozoides de muestras de controles fértiles con abortos de repetición antes y después de un tratamiento oral con antioxidantes usando el marcaje isobárico TMT. Se han identificado 34 proteínas con expresión diferencial entre los grupos de abortos de repetición y controles fértiles, además algunas proteínas mejoran su perfil de expresión después del tratamiento con antioxidantes, indicando que son vulnerables al estrés oxidativo. Sin embargo, no hay diferencias significativas entre los abortos de repetición antes y después del tratamiento con antioxidantes, por lo tanto, la patología espermàtica producida en estos pacientes no se debe principalmente al estrés oxidativo. Finalmente, el análisis de interacciones entre las proteínas diferenciales ha mostrado tres vías principales de afectación: metabolismo, citoesqueleto y daño en el ADN de los espermatozoides.

En conjunto, los resultados obtenidos demuestran la importancia del estudio de las proteínas que se expresan de manera diferencial entre individuos fértiles e infértiles ya que permite profundizar en el conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en la infertilidad masculina y personalizar el diagnóstico de pacientes con la construcción de nuevos paneles de biomarcadores.

Routine evaluation of sperm quality during the initial diagnosis of male fertility is performed by macroscopic and microscopic examination of the semen sample. These provide useful information regarding sperm count, sperm motility, sperm morphology but not on the fertilization potential of the sample often have a limited prognostic value in processes of natural and/or artificial fertilization. In addition, some studies determine that there are cases of male infertility that can be misdiagnosed as idiopathic, as there are certain abnormalities at the molecular or genetic level that do not present detectable manifestations with basic semen analysis. To address this problem it is necessary to obtain new biomarkers that help to better understand the molecular mechanisms involved in fertilization.To this end, differential expression proteomic techniques have been used in both seminal plasma and sperm samples in this work.

In the first study, the presence of nuclease activity in the seminal plasma of different groups of patients has been found in all of them, including those that do not have sperm, with azoospermia. In addition, an increase in sperm nuclease activity has been observed in patients with most altered parameters of semen analysis, as well as a correlation between nuclease activity and sperm DNA fragmentation assessed by alkaline Comet, morphology and sperm motility. Finally, the ROC curve has shown that nuclease activity is a good variable for predicting male infertility and could therefore improve the diagnosis of idiopathic patients. In the second study, the protein profile of seminal plasma from fertile donors was compared with patients selected according to their seminogram, pathology, and sperm DNA integrity values using neutral and alkaline Comet, and SCD test. 24 samples analyzed were classified into 4 different groups: fertile donors, recurrent miscarriage, asthenoteratozoospermic and asthenoteratozoospermic with varicocele. Comparative proteomic analysis was performed with the two-dimensional gel electrophoresis system based on fluorescent labeling (2D-DIGE) and revealed the presence of 28 differential proteins that are involved in metabolic and cellular processes, catalytic functions and located in the extracellular component. Analysis of protein interactions has shown that they are associated with each other and also to Ubiquitin C, indicating that the regulation of these proteins plays an important role in male infertility. In the third study, protein profile of sperm from fertile donor samples was compared with recurrent miscarriage before and after oral treatment with antioxidants using TMT isobaric labeling. 34 proteins with differential expression have been identified between groups of recurrent miscarriage and fertile donors, in addition some proteins ameliorated their expression after treatment with antioxidants, indicating that they are vulnerable to oxidative stress. However, no significant differences between recurrent miscarriages before and after antioxidant treatment have been found, therefore, damage produced in sperm from patients with this pathology is not mainly due to oxidative stress. In addition, analysis of interactions between differential proteins showed three main pathways of involvement: metabolism, cytoskeleton, and sperm DNA damage.

In summary, results obtained demonstrate the usefulness of proteomic analysis and the importance of the study of proteins that are differentially expressed between fertile and infertile individuals as it allows to deepen the knowledge of the molecular mechanisms involved in male infertility and be able to personalize the diagnosis of patients with new biomarker panels.