Posada a punt i aplicació d'una nova tècnica per a la caracterització del reservori del VIH i avaluació d'un nou compost natural com a agent reversor de la latència

Abstract

Tot i que la teràpia antiretroviral ha suposat un enorme avenç en quan a la cronificació de la infecció pel VIH-1, encara avui dia la malaltia és incurable. L’eficàcia de la TAR és indiscutible, però l’aturada del tractament es tradueix sistemàticament en un rebot de la càrrega viral plasmàtica que serà degut, principalment, a l’existència de reservoris latents que s’estableixen molt ràpidament en el moment de la infecció i que poden romandre en l’organisme llargs períodes de temps. S’han dissenyat diverses estratègies o aproximacions que tenen com a objectiu trobar la cura per la infecció causada pel VIH, ja sigui per una eliminació radical dels reservoris latents o bé, pel control de la replicació en absència de tractament acompanyat d’una millora de la funcionalitat del sistema immunitari de l’hoste. Així doncs, per a que aquesta aproximació tingui èxit és necessari que es reactivin els provirus competents de les cèl·lules infectades, actuant sobre un ampli ventall de subpoblacions; es produeixin efectes mínims sobre altres tipus cel·lulars evitant així possibles toxicitats off-target; s’estimulin mecanismes de mort en les cèl·lules infectades i s’eviti una activació global de les cèl·lules T. Per tots aquests motius és imprescindible una bona caracterització d’aquests reservoris virals per tal de poder dissenyar estratègies dirigides a eliminar-los. A més, és imperatiu trobar nous agents reversors de latència que permetin una reactivació dels virus a nivell de cèl·lules T CD4+ sense tenir un efecte negatiu sobre la resta de cèl·lules del sistema immunitari, com serien les cèl·lules T CD8+ citotòxiques.

En la present tesi doctoral s’ha posat a punt una nova tècnica, anomenada RNA/FISH flow, en el context de la infecció pel VIH. Aquesta tècnica permet la detecció de molècules d’ARN mitjançant la hibridació in situ fluorescent (FISH) combinada amb un mètode d’amplificació de la senyal i, per l’altra banda, l’immunofenotipatge mitjançant anticossos conjugats amb fluorocrom contra proteïnes intracel·lulars i de superfície cel·lular. Totes aquestes dades seran posteriorment recollides i analitzades a través d’un citòmetre de flux. L’ús d’aquesta tècnica ha permès identificar les cèl·lules efectores de memòria (TEM) com la subpoblació cel·lular que suporta majoritàriament la transcripció viral activa tant en pacients virèmics com en aquells amb la càrrega viral suprimida. A més, l’estudi i caracterització de les subpoblacions cel·lulars que actuen com a reservori del virus i que poden respondre a l’estimulació exògena per part de diferents agents reversors de la latència (LRAs), fent ús d’aquesta nova tècnica, ha determinat que els agents reversors de la latència indueixen una resposta heterogènia en les diferents subpoblacions de cèl·lules T CD4+ de pacients infectats pel VIH; i s’ha identificat la combinació de Romidepsina i Ingenol com una de les més potents. Finalment, s’ha proposat i l’avaluat l’àcid làuric, un àcid gras de cadena mitjana, com a nou inductor de la reactivació viral. Els resultats obtinguts in vitro demostren la capacitat d’aquest compost natural per induir la transcripció i producció de proteïna viral al mateix temps que promou una reprogramació del metabolisme cel·lular sense afectar a la capacitat citotòxica de les cèl·lules T CD8+.

En conclusió, el RNA/FISH flow es determina com una tècnica vàlida per estudiar el reservori transcripcionalment actiu i avaluar compostos que actuïn com a agents reversors de latència, entre d’altres; i es postula l’àcid làuric com un nou LRA prometedor per ser testat en futurs assajos clínics.

Aunque la terapia antirretroviral ha supuesto un enorme avance en cuanto a la cronificación de la infección por el VIH-1, hoy en día la enfermedad sigue siendo incurable. La eficacia de la TAR es indiscutible, pero la interrupción del tratamiento se traduce sistemáticamente en un rebote de la carga viral plasmática debido, principalmente, a la existencia de reservorios latentes que se establecen muy rápidamente en el momento de la infección y que pueden permanecer en el organismo largos períodos de tiempo. Se han diseñado varias estrategias o aproximaciones que tienen como objetivo encontrar la cura para la infección causada por el VIH, ya sea por una eliminación radical de los reservorios latentes o bien, por el control de la replicación en ausencia de tratamiento acompañado de una mejora de la funcionalidad del sistema inmunitario del huésped. Así pues, para que esta aproximación tenga éxito es necesario que se reactiven los provirus competentes de las células infectadas, actuando sobre un amplio abanico de subpoblaciones; provoque efectos mínimos sobre otros tipos celulares evitando así posibles toxicidades off-target; se estimulen mecanismos de muerte en las células infectadas y se evite una activación global de las células T. Por todos estos motivos es imprescindible una buena caracterización de los reservorios virales para poder diseñar estrategias dirigidas a eliminarlos. Además, es imperativo encontrar nuevos agentes reversores de la latencia que permitan una reactivación de los virus a nivel de células T CD4+ sin tener un efecto negativo sobre el resto de células del sistema inmunitario, como serían las células T CD8+ citotóxicas.

En la presente tesis doctoral se ha puesto a punto una nueva técnica, denominada RNA/FISH flow, en el contexto de la infección por el VIH. Esta técnica permite la detección de moléculas de ARN mediante la hibridación in situ fluorescente (FISH) combinada con un método de amplificación de la señal y, por otro lado, el inmunofenotipaje mediante anticuerpos conjugados con fluorocromos contra proteínas intracelulares y de superficie celular. Todos estos datos serán posteriormente recogidos y analizados por un citómetro de flujo. El uso de esta técnica ha permitido identificar las células efectoras de memoria (TEM) como la subpoblación celular que soporta mayoritariamente la transcripción viral activa tanto en pacientes virémicos como en aquellos con la carga viral suprimida. Además, el estudio y caracterización de las subpoblaciones celulares que actúan como reservorio del virus y que pueden responder a la estimulación exógena por parte de diferentes agentes reversores de la latencia (LRAs), usando esta nueva técnica, ha determinado que los LRA inducen una respuesta heterogénea en las diferentes subpoblaciones de células T CD4+ de pacientes infectados por el VIH y se ha identificado la combinación de Romidepsina y Ingenol como una de las más potentes para reactivar el virus. Finalmente, se ha propuesto y evaluado el ácido láurico, un ácido graso de cadena mediana, como nuevo inductor de la reactivación viral. Los resultados obtenidos in vitro demuestran la capacidad de este compuesto natural para inducir la transcripción y producción de proteína viral a la vez que promueve una reprogramación del metabolismo celular sin afectar a la capacidad citotóxica de las células T CD8+.

En conclusión, el RNA/FISH flow se determina como una técnica válida para estudiar el reservorio transcripcionalmente activo y evaluar compuestos que actúen como agentes reversores de latencia, entre otros; y se postula el ácido láurico como un nuevo LRA prometedor para ser testado en futuros ensayos clínicos.

Current antiretroviral drugs maintain the viral load under the limit of detection; however, the interruption of the treatment results in an immediate rebound of the virus. The presence of latent cell reservoirs that persist in antiretroviral treated HIV-infected patients is considered the main obstacle to cure HIV. Several strategies are investigated as an additional treatment despite ART, aimed to reduce or eliminate the HIV reservoirs. The "shock and kill" strategy is based on the reactivation of the latent virus using drugs called latency reversal agents (LRAs), and the killing of those reactivated cells by the cytopathic effects or the action of the immune system. To achieve a successful cure, it is needed to reactivate all the competent provirus of infected cells, to induce a broader reactivation in all subpopulations where HIV is hidden without affecting other cell types avoiding off-target toxicities; and to promote cell death of reactivated cells and without inducing a global activation of T cells. Therefore, it is essential to perform an in-deep characterization of the viral reservoir and to find new latency reversal agents able to induce HIV reactivation without impairing the cytotoxic capacity of immune cells.

In this PhD thesis, a new technique, so-called RNA/FISH flow, has been developed in the context of the HIV infection. This technique allowed the detection of RNA molecules by fluorescent in situ hybridization (FISH) combined with a signal amplification method and the immunophenotyping of transcriptionally active cells using fluorochrome-conjugated antibodies against intracellular and cell surface proteins. All data were collected and analysed using a flow cytometer. Using this novel technique, we identified memory effector CD4+T cells (TEM) as the main cell population supporting the HIV-RNA transcription both in viremic patients and in those with suppressed viral load. Furthermore, the study and characterization by the RNA/FISH flow method of the cell subpopulations that are susceptible to HIV reactivation by different latency-reversing agents (LRAs) determined that LRAs induced a heterogeneous response in the different subpopulations of CD4+T cells of HIV-infected patients, and identified Romidepsin and Ingenol as one of the most potent combinations at reactivating HIV. Finally, lauric acid, a medium-chain fatty acid, has been proposed and evaluated as a new LRA. The results obtained in vitro demonstrated the ability of this natural compound to induce the HIV transcription and production of viral proteins. Moreover, lauric acid significantly reprogramed the metabolic signatures of host cells preserving the cytotoxic capacity of CD8+ T cells at killing viral-reactivated cells from primary cell reservoirs.

In conclusion, the RNA/FISH flow method is determined as a valid technique to study the transcriptionally active HIV reservoir and to evaluate compounds with HIV latency reversal capacity (LRA). Furthermore, lauric acid is postulated, for the first time, as a promising new LRA to be tested in future clinical trials.