Kazrin C Controls Endocytic Trafficking and is a Double Regulator of Actin Polymerisation and Microtubule Transport

Abstract

Les cèl·lules eucariotes internalitzen i redistribueixen les molècules de la superfície a través de la ruta endocítica. Aquest és un procés clau per a l’adquisició de nutrients i el catabolisme que també controla l’exposició de receptors i complexos d’adhesió cel·lular, entre d’altres. Treballs anteriors del nostre laboratori van identificar la kazrina C com una proteïna que bloquejava l’endocitosi depenent de clatrina (CME) quan es sobreexpressava.

El treball exposat a aquesta tesi confirma el paper de la kazrina en CME, ja que les cèl·lules KO de kazrina generades pel sistema de CRISPR-cas9 no van internalitzar correctament la transferrina (Tfn), un marcador endocític. La kazrina C va co-localitzar amb marcadors d’unions adherents com la N-cadherina a la membrana plasmàtica i en estructures intracel·lulars. De fet, un fraccionament subcel·lular va demostrar la presència de la kazrina als early endosomes (EEs). En concordança amb un paper de la kazrina a EEs, la seva depleció va provocar una acumulació de EEs que contenien N-cadherina, que a més tenien una distribució més perifèrica que a les cèl·lules control. Les cèl·lules KO de kazrina no transportaven Tfn cap al compartiment de reciclatge endocític (ERC) i tenien el conseqüent defecte al reciclatge de Tfn. Tots els fenotips en les cèl·lules KO de kazrina es van recuperar amb la re-expressió de GFP-kazrina C però no amb la de GFP. Aquestes evidències apunten cap a un paper de la kazrina C al reciclatge endosomal i al transport de EEs cap al ERC. En consonància amb aquesta hipòtesi, la depleció de kazrina va causar defectes en processos cel·lulars que depenen del reciclatge a través del ERC, com ara la migració cel·lular i la citoquinesi.

Aquest estudi també va analitzar els mecanismes moleculars de la funció de la kazrina C en el tràfic endocític. Es va demostrar que la kazrina C interacciona amb els motors associats a microtúbuls kinesina-1 i dineïna, i que s’uneix directament a la cadena intermitja lleugera de la dineïna, LIC1. De fet, la kazrina C té un domini coiled-coil similar als dels adaptadors de la dineïna. La kazrina C també té en comú amb aquests adaptadors la localització a la regió pericentriolar, on semblava atrapar EEs. Per tant, proposem que la kazrina C promou el transport de EEs a través de microtúbuls, probablement com un adaptador de EEs i la dineïna. En la mateixa línia, aquest i anteriors estudis del laboratori van mostrar una interacció directa i co-localitzacions parcials de la kazrina C amb components de EEs, com l’adaptador de clatrina AP-1 i les GTPases EHD1/3. A més, la kazrina C va interaccionar amb PI3P i amb la PI3K de classe III, i la seva depleció va causar un augment als nivells endosomals de la sonda de PI3P GFP-FYVE. Finalment, establim una relació entre la kazrina C i un altre element clau del trànsit endocític: la maquinària de polimerització d’actina associada a Arp2/3. Es van observar interaccions directes amb la cortactina i el N-WASP, així com la co-localització de la GFP-kazrina C i la cortactina a la membrana plasmàtica i estructures intracel·lulars. A més, la depleció de la kazrina va provocar una reducció en l’actina ramificada cortical i un augment en l’endosomal.

En conjunt, hem provat una funció de la kazrina C al reciclatge endosomal i proposem que aquesta funció ocorre a través de la regulació del transport a través de microtúbuls, la polimerització d’actina i el metabolisme de PI3P.

Las células eucariotas internalizan y redistribuyen las moléculas de su superficie a través de la ruta endocítica. Este es un proceso clave para la adquisición de nutrientes y el catabolismo que también controla la exposición de receptores y complejos de adhesión celular, entre otros. Trabajos anteriores de nuestro laboratorio identificaron la kazrina C como una proteína que bloqueaba la endocitosis dependiente de clatrina (CME) cuando se sobreexpresaba.

El trabajo expuesto en esta tesis confirma el papel de la kazrina en la CME, al demostrar que células KO de kazrina generadas por el sistema de CRISPR-cas9 no internalizaban correctamente la transferrina (Tfn), un marcador endocítico. La kazrina C co-localizó con marcadores de uniones adherentes como la N-cadherina en la membrana plasmática y en estructuras intracelulares. De hecho, un fraccionamiento subcelular demostró la presencia de la kazrina en endosomas tempranos (EEs). Además, la depleción de la kazrina provocó una acumulación de EEs con N-cadherina, y estos tenían una distribución más periférica que en las células control, lo cual es coherente con un papel de la kazrina en EEs. Las células KO de kazrina incubadas con Tfn no transportaban el cargo hacia el compartimento de reciclaje endocítico (ERC) y tenían el consiguiente defecto en el reciclaje de Tfn. Todos los fenotipos en las células KO de kazrina se recuperaron con la re-expresión de GFP-kazrina C pero no con la de GFP. Estas evidencias apuntan hacia un papel de la kazrina C en el reciclaje endosomal y el transporte de EEs hacia el ERC. De acuerdo con esta hipótesis, la depleción de la kazrina causó defectos en procesos celulares que dependen del reciclaje a través del ERC, tales como la migración celular y la citoquinesis.

Este estudio también analiza los mecanismos moleculares de la función de la kazrina C en el tráfico endocítico. Se demostró que la kazrina C interacciona con los motores asociados a microtúbulos kinesina-1 y dineína, y que se une directamente a la cadena intermedia ligera de la dineína, LIC1. De hecho, la kazrina C tiene un dominio coiled-coil similar a los de los adaptadores de la dineína. La kazrina C tiene también en común con estos adaptadores su localización en la región pericentriolar, donde parecía atrapar EEs. Por lo tanto, proponemos que la kazrina C promueve el transporte de EEs a través de microtúbulos, probablemente como un adaptador de EEs y la dineína. En consonancia, este y anteriores estudios del laboratorio mostraron una interacción directa y co-localizaciones parciales de la kazrina C con componentes de EEs, tales como el adaptador de clatrina AP-1 y las GTPasas EHD1/3. Además, la kazrina C interaccionó con PI3P y con la PI3K de clase III, y su depleción causó un aumento en los niveles endosomales de la sonda de PI3P GFP-FYVE. Por último, hemos establecido una relación entre la kazrina C y otro elemento clave del tráfico endocítico: la maquinaria de polimerización de actina asociada a Arp2/3. Se observaron interacciones directas con la cortactina y el N-WASP, así como la co-localización de la GFP-kazrina C y la cortactina en la membrana plasmática y estructuras intracelulares. La depleción de la kazrina causó una reducción en la actina ramificada cortical y un aumento en la endosomal.

En conjunto, probamos una función de la kazrina C en el reciclaje endosomal y proponemos que esta función está mediada por la regulación del transporte a través de microtúbulos, la polimerización de actina y el metabolismo de PI3P.

Eukaryotic cells internalise and redistribute the molecules from their surface through the endocytic pathway. This process is key to nutrient uptake and catabolism, and controls the surface exposure of signalling receptors and cell adhesion complexes, among others. Previous work in the laboratory identified kazrin C as a protein that blocked Clathrin-Mediated Endocytosis (CME) when overexpressed.

The work presented in this thesis further supported the role of kazrin in CME, as kazrin KO cells generated with the CRISPR-cas9 system were defective in the uptake of the endocytic marker Transferrin (Tfn). Kazrin C co-localised with markers of adherence junctions, such as N-cadherin, at the plasma membrane and on intracellular structures. Indeed, subcellular fractionation analysis showed the localisation of kazrin in Early Endosomes (EEs). Consistent with a role of kazrin in EEs, kazrin depletion caused an accumulation of N-cadherin-loaded EEs, which showed a more peripheral distribution as compared to WT cells. Kazrin KO cells loaded with Tfn were unable to transport the cargo towards the Endocytic Recycling Compartment (ERC) and had a concomitant defect in Tfn recycling. All phenotypes on KO cells were recovered by the re-expression of GFP-kazrin C but not GFP. These evidences indicated a role of kazrin C in endosomal recycling and the transport of EEs towards the ERC. In agreement with this hypothesis, kazrin depletion caused defects in cellular processes that strongly depend on recycling through the ERC, such as cell migration and cytokinesis.

This study also analysed the molecular mechanisms of kazrin C function in endocytic traffic. Kazrin C was found to interact with the microtubule motors kinesin-1 and dynein, and directly bind to the dynein Light Intermediate Chain LIC1. In fact, kazrin C contains a coiled-coil domain similar to those found in dynein adaptors. Also similar to those, GFP-kazrin C localised to the pericentriolar region, where it seemed to trap EEs. Therefore, we proposed that kazrin C promoted microtubule-dependent transport of EEs, possibly as an EE dynein adaptor. Accordingly, this and previous studies in the laboratory showed direct interactions and partial co-localisations of kazrin C with EE components, such as the AP-1 clathrin adaptor complex and EHD1/3 GTPases. In addition, kazrin C interacted with PI3P and the class III PI3K, and its depletion caused an increase in the endosomal levels of the PI3P probe GFP-FYVE. Finally, we linked kazrin C with another player in endocytic traffic: the Arp2/3-associated machinery for actin polymerisation. Direct interactions were observed with cortactin and N-WASP, as well as co-localisation of GFP-kazrin C with cortactin at the plasma membrane and intracellular structures. Moreover, kazrin depletion caused a reduction in cortical and an increase in endosomal branched actin.

Altogether, we proved that kazrin C functions in endosomal recycling and propose that this function is mediated by the regulation of microtubule-dependent transport, actin polymerisation and PI3P metabolism.