Caracterización histológica, molecular y metabólica de la progresión fenotípica de la enfermedad de McArdle en el modelo murino

Abstract

La malaltia del McArdle, o glucogenosi tipus V, és una malaltia autosòmica recessiva causada per mutacions en les dues còpies de gen PYGM, que codifica per l’enzim GP-M, situat al braç llarg del cromosoma 11 humà (11.q.13.1). L’activitat d’aquest enzim és nul·la en pacients amb aquesta malaltia, per això en el múscul esquelètic d’aquests malalts hi ha grans acumulacions de glucogen subsarcolèmic. Aquesta malaltia és habitual que apareixi durant les primeres etapes de la infància, però un 47% dels casos no són diagnosticats fins la tercera dècada de la vida dels pacients, com a conseqüència de la condició de malaltia rara i que els seus símptomes, en alguns casos, poden arribar a ser molt lleus. Els malalts que pateixen aquesta malaltia presenten intolerància a l’exercici, que es manifesta en forma de crisis agudes de fatiga prematura, rampes i contractures, i aquesta pot anar acompanyada de dany muscular i rabdomiòlisi, hiper-CK-emia i mioglobinuria. L’acumulació anormal de glucogen en el teixit muscular dels afectats per la malaltia de McArdle, produeix un dany progressiu en l’estructura de les seves fibres musculars que li confereix unes característiques histològiques típiques a aquest teixit muscular observant-se la presència de vacúols subsarcolémicas i intracitoplásmicas per la acumulació de glicogen no degradat. En el nostre grup es va abordar el desenvolupament d’un model murí knock-in per a la mutació p.R50X a PYGM, la més freqüent en pacients Caucàsics. La generació i posterior caracterització d’aquest model animal ha demostrat que presenta les principals característiques fenotípiques dels pacients amb aquesta malaltia. El present estudi ha permès una caracterització més detallada d’aquest model murí en el que s’ofereix una visió més completa de les dificultats que presenta així com de les característiques físiques, bioquímiques, estructurals i d’adaptació d’aquest respecte a l’evolució d’aquesta patologia. Els resultats obtinguts ens han permès determinar que aquest model animal pateix una elevada taxa de mortalitat tant perinatal com post deslletament del que es podria esperar de l’herència Mendeliana que presenta la malaltia, i que influeix negativament en l’obtenció de ratolins McA. A nivell estructural, aquests ratolins presenten una major desestructuració muscular, amb gran variabilitat de la mida de les seves fibres que també presenten vacuolizaciones, i un increment tant de l’nombre de NC com de l’area d’ECM, característiques que es veuen potenciades amb l’avanç de la malaltia . Així, els músculs QUAD i soleus semblen més capaços de resistir els successius processos de degeneració / regeneració, mantenint la seva estructura segons avança la malaltia, al contrari del que succeeix amb els músculs GAST, EDL i TA, que es veuen estructuralment més afectats amb l’evolució de la mateixa. En aquesta línia, les fibres musculars dels músculs soleus i QUAD es veuen menys afectades per l’atròfia, i més concretament les fibres tipus I i les mixtes tipus IIx / IIb que són preponderants en aquests respectius músculs, el que els hi confereix protecció davant del dany crònic produït per l’evolució de la malaltia del McArdle. Aquesta propietat protectora sorgeix, d’una banda, com a conseqüència de la capacitat que tenen aquests tipus de fibres per ressistir els cicles de degeneració/regeneració, evitant així l’artròfia; i d’altra, de la seva versatilitat metabòlica per l’establiment de mecanismes alternatius d’energia a través de la captació de glucosa. Així mateix, les dades metabòliques obtingudes juntament amb les característiques bioquímiques i físiques observades en aquest model animal, ens han permès determinar que els ratolins McA tenen certa capacitat d’adaptació per minimitzar els efectes de la manca energètica que la malaltia provoca en el teixit muscular.

La enfermedad de McArdle, o glucogenosis tipo V, es una enfermedad autosómica recesiva, causada por mutaciones en ambas copias del gen PYGM, que codifica para la enzima GP-M, situado en el brazo largo del cromosoma 11 humano (11.q.13.1). La actividad de dicha enzima es nula en pacientes con esta enfermedad, por ello en el músculo esquelético de estos enfermos hay grandes acumulaciones de glucógeno subsarcolémico. La enfermedad suele aparecer en las primeras etapas de la infancia, sin embargo un 47 % de los casos no son diagnosticados hasta pasada la tercera década de vida de los pacientes, dada su condición de enfermedad rara y que sus síntomas pueden llegar a ser muy leves en algunos casos. Los enfermos que padecen esta enfermedad presentan intolerancia al ejercicio, que se manifiesta en forma de crisis agudas de fatiga prematura, rampas y contracturas, pudiendo ésta ir acompañada de daño muscular y rabdomiolisis, hiper-CK-emia y mioglobinuria. La acumulación anormal de glucógeno en el tejido muscular de los afectados por la enfermedad de McArdle, produce un daño progresivo en la estructura de sus fibras musculares que le confiere unas características histológicas típicas a este tejido muscular observándose la presencia de vacuolas subsarcolémicas e intracitoplásmicas por la acumulación de glucógeno no degradado. Para su estudio, en nuestro grupo se abordó el desarrollo de un modelo murino knock-in para la mutación p.R50X en PYGM, la más frecuente en pacientes Caucásicos. La generación y posterior caracterización de este modelo animal ha demostrado que presenta las principales características fenotípicas de los pacientes con esta enfermedad. El presente estudio ha permitido una caracterización más detallada de este modelo murino revelando una visión más completa de las dificultades que presenta así como de las características físicas, bioquímicas, estructurales y de adaptación de éste respecto a la evolución de esta patología. Los resultados obtenidos nos han permitido determinar que este modelo animal sufre una elevada tasa de mortalidad tanto perinatal como post destete con respecto a lo que cabría esperar de la herencia Mendeliana que presenta la enfermedad, y que influye negativamente en la obtención de ratones McA. A nivel estructural, estos ratones presentan una mayor desestructuración muscular, con gran variabilidad del tamaño de sus fibras que también presentan vacuolizaciones, y un incremento tanto del número de NC como del area de ECM, características que se ven potenciadas con el avance de la enfermedad. Así mismo, los músculos QUAD y soleus parecen ser más capaces de resistir los sucesivos procesos de degeneración/regeneración, manteniendo su estructura según avanza la enfermedad, al contrario de lo que sucede con los músculos GAST, EDL y TA, que se ven estructuralmente más afectados con la evolución de la misma. En esta línea, las fibras musculares de los músculos soleus y QUAD se ven menos afectadas por la atrofia, y más concretamente las fibras tipo I y las mixtas tipo IIx/IIb que son preponderantes en esos respectivos músculos, lo que les confiere protección frente al daño crónico producido por la evolución de la enfermedad de McArdle. Esta propiedad protectora se debe a la capacidad de estos tipos de fibras para hacer frente a los ciclos de degeneración/regeneración evitando la atrofia y a su versatilidad metabólica a la hora de establecer mecanismos alternativos de obtención de energía mediante la captación de glucosa. Así mismo, los datos metabólicos obtenidos junto con las características bioquímicas y físicas observadas en este modelo animal, nos han permitido determinar que los ratones McA tienen cierta capacidad de adaptación para minimizar los efectos que la carencia energética producida por la enfermedad provoca en el tejido muscular.

McArdle's disease, or type V glycogenosis, is an autosomal recessive disease, caused by mutations in both copies of the PYGM gene, which codes for the GP-M enzyme, located on the long arm of human chromosome 11 (11.q.13.1 ). The activity of this enzyme is null in patients with this disease, therefore in the skeletal muscle of these patients there are large accumulations of subsarcolemic glycogen. The disease usually appears in the early stages of childhood, however 47% of cases are not diagnosed until after the third decade of life of the patients, given its condition as a rare disease and that its symptoms can be very mild in some cases. Patients with this disease present intolerance to exercise, which manifests itself in the form of acute attacks of premature fatigue, cramps and contractures, which may be accompanied by muscle damage and rhabdomyolysis, hyper-CK-aemia and myoglobinuria. The abnormal accumulation of glycogen in the muscle tissue of those affected by McArdle's disease produces progressive damage to the structure of their muscle fibers that confers typical histological characteristics to this muscle tissue, observing the presence of sub-sarcolemic and intracytoplasmic vacuoles through the accumulation of non-degraded glycogen. For its study, our group addressed the development of a knock-in murine model for the p.R50X mutation in PYGM, the most frequent in Caucasian patients. The generation and subsequent characterization of this animal model has shown that it presents the main phenotypic characteristics of patients with this disease. The present study has allowed a more detailed characterization of this murine model, revealing a more complete vision of the difficulties it presents as well as its physical, biochemical, structural and adaptation characteristics regarding the evolution of this pathology. The results obtained have allowed us to determine that this animal model suffers a high perinatal and post-weaning mortality rate with respect to what would be expected from the Mendelian inheritance that the disease presents, and that it negatively influences the obtaining of McA mice. At the structural level, these mice present a greater muscular destructuring, with great variability in the size of their fibers that also present vacuolizations, and an increase in both the number of NC and the area of ECM, characteristics that are enhanced with the progression of the disease. Likewise, the QUAD and soleus muscles seem to be more capable of resisting the successive processes of degeneration / regeneration, maintaining their structure as the disease progresses, contrary to what happens with the GAST, EDL and TA muscles, which are structurally more visible affected with the evolution of it. In this line, the muscle fibers of the soleus and QUAD muscles are less affected by atrophy, and more specifically the type I fibers and the mixed type IIx / IIb fibers that are preponderant in these respective muscles, which gives them protection against the chronic damage produced by the evolution of McArdle's disease. This protective property is due to the ability of these types of fibers to cope with the degeneration / regeneration cycles avoiding atrophy and to their metabolic versatility when establishing alternative mechanisms for obtaining energy through glucose uptake. Likewise, the metabolic data obtained together with the biochemical and physical characteristics observed in this animal model, have allowed us to determine that McA mice have a certain capacity for adaptation to minimize the effects that the energy deficiency produced by the disease causes in muscle tissue.