Targeted drug delivery for the selective elimination of CXCR4+ cancer cells in metastatic colorectal cancer models

Abstract

El càncer colorectal (CCR) representa la tercera causa de mortalitat per càncer en països occidentals, essent les metàstasis la principal causa de mort. Tot i el progrés en les estratègies de prevenció que han disminuït la incidència i mortalitat del CCR, prop d’un quart dels pacients encara són diagnosticats en estadis metastàtics avançats, amb una taxa de supervivència a cinc anys de només el 15%. És per això que la inhibició del desenvolupament de metàstasis actuant sobre cèl·lules mare canceroses incrementarà significativament els beneficis de les teràpies actuals. En col·laboració amb el grup de recerca en Nanobiotecnologia de la UAB, hem desenvolupat nanopartícules proteiques autoensamblables dirigides al receptor CXCR4, la sobreexpressió del qual es correlaciona amb la disseminació tumoral, baixa supervivència, i recurrència en pacients de CCR. L’avaluació preclínica de l’eficàcia i toxicitat del nanoportador T22-GFP-H6 i els seus derivats terapèutics requereix l’ús de models in vivo de CCR disseminats. Amb aquest objectiu, hem desenvolupat models de CCR subcutanis i altament metastàtics que sobreexpressen CXCR4, derivats de la línia cel·lular de CCR SW1417 o de la mostra de pacient SP5. Per tal d’incrementar l’eficiència metastàtica dels models CXCR4+ anteriors, vam implantar ortotòpicament cèl·lules SW1417 amb expressió de luciferasa en el cec de ratolins amb immunodeficiència severa. Els ratolins NOD/SCID (deficients en cèl·lules T i B), presentaren taxes metastàtiques baixes. Per contra, la microinjecció ortotòpica en ratolins NSG (deficients en cèl·lules T, B i NK), replicà el patró de disseminació observat en pacients, provocant la mort dels ratolins i un nombre i mida més gran de metàstasis hepàtiques i pulmonars en comparació als ratolins NOD/SCID. En l’avaluació de la biodistribució de les nanopartícules, tal i com indica l’emissió de fluorescència (al voltant del 70% del total), la T22-GFP-H6 va assolir una alta acumulació selectiva en tumors del model subcutani CXCR4+, mentre que l’acumulació en òrgans no tumorals fou només transitòria. Vam demostrar que l’acumulació al tumor del nanoportador és CXCR4-dependent, perquè el pretractament amb AMD3100, un antagonista de CXCR4, va reduir l’acumulació tumoral. A més, aquesta va incrementar amb la funcionalització del nanoportador amb el pèptid fusogènic HA2, que afavoreix l’escapament endosomal. Per altra banda, vam observar que el nanoconjugat terapèutic T22-GFP-H6-Aur era capaç de mantenir la biodistribució del nanoportador, però el seu efecte antitumoral fou sorprenentment baix. El T22-GFP-H6-Aur només va inhibir metàstasis transcel·lòmiques en un model de CCR altament metastàtic i a més, va activar una resposta immunogènica letal en la seva administració repetida en ratolins poc immunodeprimits. Com a opció terapèutica alternativa, vam substituir la proteïna GFP de la nanopartícula per la toxina PE24 desimmunitzada, per tal de reduir la seva immunogenicitat afegint al mateix temps una potent activitat citotòxica intrínseca. L’administració de dosis baixes de la nanotoxina T22-PE24-H6, va prevenir el desenvolupament de metàstasis limfàtiques i hematògenes en el model de CCR altament metastàtic sense toxicitat. Vam demostrar que la nanotoxina T22-PE24-H6 indueix la mort de cèl·lules tumorals per la via no apoptòtica de la piroptosi. En resum, l’ús de la nanotoxina T22-PE24-H6 podria ser una estratègia prometedora per a l’eliminació selectiva de cèl·lules mare de CCR CXCR4+ en absència de toxicitat sistèmica, aplicable a CCR metastàtics i resistents a la quimioteràpia que s’associïn a la sobreexpressió de CXCR4 i a mecanismes antiapoptòtics.

El cáncer colorrectal (CCR) representa la tercera causa de mortalidad por cáncer en países occidentales, siendo las metástasis la principal causa de muerte. Aunque el progreso en las estrategias de prevención ha reducido la incidencia y mortalidad del CCR, cerca de un cuarto de los pacientes aún son diagnosticados en estadios metastáticos avanzados, con una tasa de supervivencia a cinco años de solamente el 15%. Es por eso, que la inhibición del desarrollo de metástasis actuando sobre células madre cancerosas incrementará significativamente los beneficios de las terapias actuales. En colaboración con el grupo de investigación en Nanobiotecnología de la UAB, hemos desarrollado nanopartículas proteicas autoensamblables dirigidas al receptor CXCR4, la sobreexpresión del cual correlaciona con la diseminación tumoral, baja supervivencia, y recurrencia en pacientes de CCR. La evaluación preclínica de la eficacia y toxicidad del nanoportador T22-GFP-H6 y sus derivados terapéuticos, requiere el uso de modelos in vivo de CCR diseminados. Con este objetivo, hemos desarrollado modelos de CCR subcutáneos y altamente metastáticos que sobreexpresan CXCR4, derivados de la línea celular de CCR SW1417 o de la muestra de paciente SP5. Con el objetivo de incrementar la eficiencia metastática de los modelos CXCR4+ anteriores, implantamos ortotópicamente células SW1417 con expresión de luciferasa en el ciego de ratones con inmunodeficiencia severa. Los ratones NOD/SCID (deficientes en células T y B), presentaron tasas metastáticas bajas. Por contra, la microinyección ortotópica en ratones NSG (deficientes en células T, B y NK), replicó el patrón de diseminación observado en pacientes, provocando la muerte de los ratones y un mayor número y tamaño de metástasis hepáticas y pulmonares en comparación con los ratones NOD/SCID.

En la evaluación de la biodistribución de las nanopartículas, tal y como indica la emisión de fluorescencia (alrededor del 70% del total), T22-GFP-H6 alcanzó una alta acumulación selectiva en tumores del modelo subcutáneo CXCR4+, mientras la acumulación en órganos no tumorales fue solamente transitoria. Demostramos que la acumulación en tumor del nanoportador es CXCR4-dependiente, porque el pretratamiento con AMD3100, un antagonista de CXCR4, redujo la acumulación tumoral. Además, la esta incrementó con la funcionalización del nanoportador con el péptido fusogénico HA2, que favorece el escapamiento endosomal. Por otra parte, observamos que el nanoconjugado terapéutico T22-GFP-H6-Aur mantuvo la biodistribución del nanoportador, pero su efecto antitumoral fue sorprendentemente bajo. T22-GFP-H6-Aur solamente inhibió metástasis transcelómicas en un modelo de CCR altamente metastático y además activó una respuesta inmunogénica letal en su administración repetida en ratones poco inmunodeprimidos. Como opción terapéutica alternativa, sustituimos la proteína GFP de la nanopartícula por la toxina PE24 desinmunizada, a fin de reducir su inmunogenicidad añadiendo al mismo tiempo una potent actividad citotóxica intrínseca. La administración de dosis bajas de la nanotoxina T22-PE24-H6, previno el desarrollo de metástasis linfáticas y hematógenas en el modelo de CCR altamente metastático sin toxicidad. Demostramos que la nanotoxina T22-PE24-H6 induce la muerte de las células tumorales por la vía no apoptótica de la piroptosis. En conclusión, el uso de la nanotoxina T22-PE24-H6 podría ser una estrategia prometedora para la eliminación selectiva de células madre de CCR CXCR4+ en ausencia de toxicidad sistémica, aplicable a CCR metastáticos y resistentes a la quimioterapia que se asocien a la sobreexpresión de CXCR4 y a mecanismos antiapoptóticos.

Colorectal cancer (CRC) remains the third cause of cancer-related mortality in Western countries, being metastases the main cause of death. Despite progress in prevention strategies that decreased CRC incidence and mortality, still nearly a quarter of patients are diagnosed at an advanced metastatic stage, with only a 15% five-year survival rate. Thus, inhibition of metastasis development by targeting cancer stem cells, which are associated with cancer dissemination, will significantly increase the benefits of current cancer therapies. In collaboration with the Nanobiotechnology group from de UAB, we developed self-assembling protein-based nanoparticles targeting the CXCR4 receptor whose overexpression correlates with tumor dissemination, poor survival, and recurrence in CRC patients. Preclinical evaluation of the efficacy and toxicity of the T22-GFP-H6 nanocarrier and its therapeutic derivatives required the use of adequate in vivo disseminated CRC models. For that purpose, we generated subcutaneous and highly metastatic models of CRC that overexpress CXCR4, derived from the SW1417 CRC cell line or the SP5 patient sample. In order to increase the metastatic efficiency of previous CXCR4+ CRC models, we orthotopically implanted luciferase expressing SW1417 cells in the cecum of severe immunodeficient mice. NOD/SCID mice (deficient in T and B cells) presented a low metastatic rate. In contrast, orthotopic microinjection in NSG mice (deficient in T, B and NK cells) replicated the dissemination pattern observed in patients, causing mice death and resulting in a higher number and size of hepatic and pulmonary metastases as compared to NOD/SCID mice. In the assessment of nanoparticles’ biodistribution, T22-GFP-H6 achieved a highly selective tumor uptake in a CXCR4+ CRC subcutaneous model, as detected by fluorescent emission (around 70% of the total), while displaying only transient accumulation in non-tumor organs. We demonstrated that the nanocarrier tumor accumulation was CXCR4-dependent because pre-treatment with AMD3100, a CXCR4 antagonist, reduced tumor uptake. Furthermore, tumor accumulation was increased by the functionalization of the nanocarrier with the fusogenic HA2 peptide, which promotes endosomal escape. On the one hand, we observed that the therapeutic nanoconjugate T22-GFP-H6-Aur maintained the nanocarrier’s biodistribution but its antitumoral effect was surprisingly poor. T22-GFP-H6-Aur inhibited only tanscelomic metastasis in a highly metastatic CRC model, while activating a lethal immunogenic response when repeatedly administered in low immunosuppressed mice. As an alternative therapeutic option, we replaced the GFP protein in the nanoparticle by the de-immunized PE24 toxin, to reduce its immunogenicity while promoting a potent and intrinsic cytotoxic activity. The administration of low doses of the T22-PE24-H6 nanotoxin prevented the development of lymphatic and hematogenous metastasis in the highly metastatic CRC model without toxicity. We demonstrated that the T22-PE24-H6 nanotoxin induced cancer cell death through the non-apoptotic pathway, pyroptosis. In conclusion, the use of the T22-PE24-H6 nanotoxin could be a promising strategy to selectively eliminate CXCR4+ CRC stem cells in the absence of systemic toxicity, applicable to chemotherapy-resistant and disseminated CRC associated with the upregulation of CXCR4 and antiapoptotic mechanisms.