Molecular analysis of Smc5/6-dependent sumoylation and ubiquitination

Abstract

Les cèl·lules eucariotes dediquen grans esforços per mantenir la integritat del seu genoma. Els complexos SMC (Structural Maintenance of Chromosomes), que inclouen la cohesina, la condensina i el complex Smc5/6, coordinen múltiples activitats cromosòmiques que protegeixen el nostre genoma. Particularment, el complex Smc5/6 té un paper clau en la reparació de l’ADN per recombinació homòloga, l’estabilització de les forquilles de replicació i la resolució de les cromàtides germanes, i és el membre més desconegut de la família SMC. A diferència de la cohesina i la condensina, conté dos dominis de tipus RING: un en la subunitat Nse1, amb potencial activitat ubiqüitina lligasa, i l’altre en la subunitat Nse2, que regula la transferència de SUMO a les proteïnes substrat. Nse2 s’uneix al coiled-coil de Smc5 a través del seu domini essencial N-terminal, mentre que la seva meitat C-terminal, que codifica per el domini SUMO lligasa, és prescindible per a la supervivència cel·lular. Malgrat això, la sumoilació de diferents subunitats dels SMC i d’altres dianes cromosòmiques depenent de Nse2 controla diverses vies biològiques directament implicades en el manteniment de la integritat genòmica. Tot i això, els processos que regulen la seva activitat SUMO E3 lligasa segueixen sent poc coneguts. En aquest estudi, es descriu un nou mecanisme mitjançant el qual la interacció entre un sensor carregat positivament en el braç de Smc5 i l’ADN estimula l’activitat SUMO E3 lligasa de Nse2. A més a més, hem realitzat un detallat anàlisi funcional de les diferents característiques estructurals presents al domini C-terminal de Nse2 en llevat. Aquesta caracterització revela que l’hèlix alfa C-terminal, que s’ha associat amb un desordre genètic rar, té una funció estructural important i afecta directament a l’estabilitat de Nse2. D’altra banda, hem identificat dues regions que incrementen la sumoilació in vitro. Sorprenentment, els nostres resultats també mostren que mutacions puntuals en residus conservats que coordinen l’àtom de zinc no afecten a la sumoilació in vivo de Smc5. L’altra subunitat del complex Smc5/6 amb un domini RING, Nse1, s’ha descrit que promou funcions de reparació de l’ADN i que manté l’estabilitat del genoma. Tot i això, fins al moment, no s’han descrit dianes per la seva activitat E3 lligasa. Aquí, fem servir proteòmica quantitativa sense marcatge per tal de comparar l’ubiquitinoma de cèl·lules wild type o mutants en el RING de Nse1. Particularment, la subunitat més gran de l’ARN POL I, Rpa190, està menys ubiquitinada en les cèl·lules nse1 mutants. Rpa190 es modifica durant la transcripció activa, i els mutants no-ubiquitinables rpa190-KR són sensibles a inhibidors de l’elongació transcripcional i són resistents a la degradació proteasomal regulada per BMH-21. En conjunt, aquests resultats proporcionen noves dades sobre la regulació i les dianes de les activitats SUMO i ubiquitina lligasa dependents de Smc5/6, que són una part crucial dels mecanismes usats pel complex Smc5/6 per tal de preservar la integritat del genoma.

Las células eucariotas dedican grades esfuerzos para mantener la integridad de su genoma. Los complejos SMC (Structural Maintenance of Chromosomes) que incluyen la cohesina, la condensina y el complejo Smc5/6, coordinan múltiples actividades cromosómicas que protegen nuestro genoma. Particularmente, el complejo Smc5/6 tiene un papel crucial en la reparación del ADN por recombinación homóloga, la estabilización de las horquillas de replicación y la resolución de cromátidas hermanas, y es el miembro más desconocido de la familia SMC. A diferencia de la cohesina o la condensina, tiene dos dominios de tipo RING: uno en la subunidad Nse1, con potencial actividad ubiquitina ligasa, y el otro en la subunidad Nse2, del que se ha descrito que regula la transferencia de SUMO a las proteínas sustrato. Nse2 se une al coiled-coil de Smc5 a través de su dominio esencial N-terminal, mientras que su mitad C-terminal, que codifica por el dominio SUMO ligasa, es prescindible para la supervivencia celular. Aun así, la sumoilación de diferentes subunidades SMC y otras dianas cromosómicas dependiente de Nse2 controla varias vías biológicas directamente implicadas en el mantenimiento de la integridad genómica. Sin embargo, los procesos que regulan su actividad E3 ligasa siguen siendo poco conocidos. En este estudio, describimos un nuevo mecanismo mediante el cual la interacción entre un sensor cargado positivamente en el brazo de Smc5 y el ADN estimula la actividad SUMO E3 ligasa de Nse2. Además, hemos realizado un detallado análisis funcional de las diferentes características estructurales presentes en el dominio C-terminal de Nse2 en levadura. Esta caracterización revela que la hélice alfa C-terminal, que se ha asociado con un desorden genético raro, tiene una importante función estructural y afecta directamente la estabilidad de Nse2. Además, hemos identificado dos regiones que incrementan la sumoilación in vitro. Sorprendentemente, nuestros resultados también muestran que las mutaciones puntuales en residuos conservados que coordinan el átomo de zinc no afectan a la sumoilación in vivo de Smc5. La otra subunidad del complejo Smc5/6 con un dominio RING, Nse1, se ha descrito que promueve funciones de reparación del ADN y que mantiene la estabilidad del genoma. Sin embargo, hasta la fecha, no se han descrito dianas para su actividad ubiquitina-E3 ligasa. Aquí, usamos proteómica cuantitativa sin marcaje para comparar el ubiquitinoma de células wild type y mutantes en el RING de Nse1. Particularmente, la subunidad mayor de la ARN POL I, Rpa190, está menos ubiquitinada en el células nse1 mutantes. Rpa190 se modifica durante la transcripción activa, y los mutantes no-ubiquitinables rpa190-KR son sensibles a inhibidores de elongación transcripcional y son resistentes a la degradación proteasomal mediada por BMH-21. En conjunto, estos resultados proporcionan nuevos datos en la regulación y las dianas de las actividades SUMO y ubiquitina ligasa dependientes de Smc5/6, que son una parte crucial de los mecanismos usados por el complejo Smc5/6 para preservar la integridad del genoma.

Eukaryotic cells devote large efforts to maintain the integrity of their genome. The Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) complexes, which include cohesin, condensin and Smc5/6, coordinate multiple chromosomal activities that safeguard our genome. Particularly, the Smc5/6 complex plays crucial roles in DNA repair by homologous recombination, replication fork stability and sister chromatid resolution, and it is the most unknown member of the SMC family. Unlike cohesin and condensin, it contains two RING-type domains: one in the Nse1 subunit, with potential ubiquitin ligase activity, and the other in the Nse2 subunit, which has been shown to mediate the transfer of SUMO to substrate proteins. Nse2 binds to the Smc5 coiled-coil through its essential N-terminal domain, whereas its C-terminal half, coding for the SUMO ligase domain, is dispensable for cell survival. Despite this, Nse2-dependent sumoylation of SMC complexes and other chromosomal targets has been reported to control several biological pathways directly involved in genome integrity. However, the processes that regulate its E3 ligase activity remain poorly understood. In this study, we describe a novel mechanism by which the interaction between a positively-charged patch in the coiled-coil of Smc5 and DNA stimulates the Nse2 SUMO E3 ligase activity. In addition, we have performed a detailed functional analysis of the different structural features present in the C-terminal domain of Nse2 in yeast. This characterization reveals that the last C-terminal alpha-helix, which has been related to a rare genetic disorder, has an important structural function and directly affects Nse2 stability. In addition, we have identified two regions that enhance sumoylation in vitro. To our surprise, our results also show that mutations in conserved residues coordinating the zinc ion do not impair Smc5-sumoylation in vivo. The other RING-type subunit of the Smc5/6 complex, Nse1, has also been described to promote DNA repair functions and to maintain genome stability. However, no targets for its ubiquitin-E3 ligase activity have been identified until now. Here, we use label-free quantitative proteomics to compare the ubiquitinome of wild type and nse1 RING mutant cells. Particularly, the largest subunit of the RNA POL I, Rpa190, is less ubiquitinated in nse1 mutant cells. Rpa190 is modified during active transcription, and non-ubiquitinable rpa190-KR cells are sensitive to transcriptional elongation inhibitors and are resistant to BMH-21-mediated proteasomal degradation. Overall, these results provide novel information on the regulation and targets of the Smc5/6-dependent SUMO and ubiquitin ligase activities, which are a critical part of the mechanisms used by the Smc5/6 complex to preserve the integrity of the genome.