Studies on transmissible viral proventriculitis in chickens

Abstract

La proventriculitis viral transmissible (TVP) és una malaltia infecciosa viral emergent que afecta principalment a les gallines de graella. Es caracteritza per una digestió de l’alimentació deficient, un creixement deficient i una taxa de conversió de l’alimentació deficient, causant pèrdues econòmiques a la indústria avícola. En casos de TVP s’observa l’ampliació, engrossiment, fragilitat i pal·lidesa del proventriculus, juntament amb debilitat i dilatació de l’istme gàstric. Tot i que les lesions greus proventriculars poden ser indicatives de TVP, no són específiques. La malaltia es caracteritza per les seves lesions histològiques: necrosi de cèl·lules oxinticopèptiques, inflamació amb predomini de limfòcits i substitució de l’epiteli glandular per epiteli ductal hiperplàsic. Per tant, l’objectiu principal d’aquesta tesi era determinar la presència de la malaltia i del nou agent viral a les granges avícoles espanyoles i caracteritzar encara més aquest agent viral mitjançant estudis ultraestructurals i tècniques de seqüenciació de propera generació. En el primer estudi, la presència de CPNV en casos clínics de TVP de granges avícoles espanyoles es va avaluar retrospectivament del 1999 al 2019 en teixit proventricular FFPE. L’examen histopatològic, la RT-PCR de CPNV i el genoma de seqüència parcial de casos positius obtinguts mitjançant la seqüència de Sanger es va dur a terme en 42 casos clínics. A més, es va configurar una nova tècnica ISH com a nou mètode per detectar el virus. L’estudi va identificar la presència de CPNV a les granges de pollastres espanyoles des de 1999 com a mínim. A més, deu proventriculi de set casos clínics diferents van ser positius per a CPNV RT-PCR i ISH, i tots ells van mostrar els trets histopatològics característics de TVP (necrosi de l’oxinticopèptic inflamació intersticial de les cèl·lules i de les glàndules). Els estudis filogenètics van demostrar que les seqüències parcials de CPNV espanyoles estaven molt relacionades amb les seqüències CPNV disponibles del Regne Unit i els EUA. El segon estudi d’aquesta tesi tenia com a objectiu identificar, visualitzar i localitzar l’agent causant de TVP mitjançant l’ús de TEM. Es van utilitzar mostres proventriculars de dotze casos clínics diferents. Vuit de les mostres van ser positives per RT-PCR i ISH a CPNV, mentre que les altres tres, tot i que presentaven una lesió brut i microscòpica coherent amb TVP, van ser negatives per a CPNV ISH i RT-PCR. Es van observar virus icosaèdrics de 70 nm, no embolcallats, intranuclears i / o intracitoplasmàtics en quatre mostres. Dues d’aquestes mostres van ser negatives per al CPNV mitjançant mètodes moleculars, mentre que les altres dues van donar resultats positius a les tècniques de RT-PCR i ISH CPNV. Aquests resultats, juntament amb la troballa de virions als nuclis de les cèl·lules infecetd, una troballa que no es sol veure en els virus d’ARN, van plantejar la qüestió de si TVP també podria ser causada per un altre agent viral simultàniament o sense la contribució de CPNV. Per entendre encara més aquesta última hipòtesi, es va fer un tercer estudi per caracteritzar encara més el genoma dels virus implicats en els casos de TVP. Es van estudiar vuit mostres de proventriculi de TVP per NGS i es van trobar seqüències parcials o completes del segment B de CPNV en tots ells, confirmant la implicació d’aquest virus en casos clínics de TVP. No obstant això, en cinc dels casos, es van trobar seqüències parcials d’adenovirus A aviari, en particular els dos casos en què s’havien observat virions intranuclears per TEM. Aquests resultats confirmen la hipòtesi que l’adenovirus A aviari pot estar present en casos clínics de TVP, tot i que el seu paper en el desenvolupament de la malaltia necessita estudis addicionals.

La proventriculitis viral transmisible (TVP) es una enfermedad infecciosa viral emergente que afecta principalmente a los pollos de engorde. Se caracteriza por una digestión deficiente de los alimentos, un crecimiento deficiente y una tasa de conversión de alimentos deficiente, lo que provoca pérdidas económicas para la industria avícola. En los casos de TVP se observa agrandamiento, engrosamiento, fragilidad y palidez del proventrículo, junto con debilidad y dilatación del istmo gástrico. Aunque las lesiones macroscópicas proventriculares podrían ser indicativas de TVP, no son específicas. La enfermedad se caracteriza por sus lesiones histológicas: necrosis de células oxinticopépticas, inflamación con predominio de linfocitos y sustitución del epitelio glandular por epitelio ductal hiperplásico. Por tanto, el objetivo principal de esta tesis fue determinar la presencia de la enfermedad y el nuevo agente viral en las granjas avícolas españolas y caracterizar este agente viral mediante estudios ultraestructurales y técnicas de secuenciación de última generación.

En el primer estudio, se evaluó retrospectivamente la presencia de CPNV en casos clínicos de TVP de granjas avícolas españolas desde 1999 hasta 2019 en tejido proventricular FFPE. En 42 casos clínicos se realizó examen histopatológico, CPNV RT-PCR y secuencia parcial del genoma de casos positivos obtenidos mediante secuencia de Sanger. Además, se estableció una nueva técnica de ISH como un nuevo método para detectar el virus. El estudio identificó la presencia de CPNV en las granjas avícolas españolas desde al menos 1999. Además, diez proventrículos de siete casos clínicos diferentes fueron positivos a CPNV RT-PCR e ISH, y todos mostraron los rasgos histopatológicos característicos de TVP (necrosis de oxinticopeptic células e inflamación intersticial de la glándula). Los estudios filogenéticos mostraron que las secuencias parciales de CPNV españolas estaban muy relacionadas con las secuencias de CPNV disponibles en Reino Unido y EE. UU.

El segundo estudio de esta tesis tuvo como objetivo identificar, visualizar y localizar el agente causante de TVP mediante el uso de TEM. Se utilizaron muestras proventriculares de doce casos clínicos diferentes. Ocho de las muestras fueron positivas por RT-PCR e ISH a CPNV, mientras que las otras tres, aunque mostraron lesiones macroscópicas y microscópicas compatibles con TVP, fueron negativas a CPNV ISH y RT-PCR. Se observaron virus icosaédricos, de 70 nm, no envueltos, intranucleares y / o intracitoplasma en cuatro muestras. Dos de estas muestras dieron negativo a CPNV por métodos moleculares, mientras que las otras dos dieron resultados positivos a las técnicas de RT-PCR e ISH CPNV. Estos resultados, junto con el hallazgo de viriones en los núcleos de las células infecciosas, un hallazgo que no suele observarse en los virus de ARN, plantearon la cuestión de si la TVP también podría ser causada por otro agente viral simultáneamente o sin la contribución del CPNV.

Para comprender aún más esta última hipótesis, se realizó un tercer estudio para caracterizar aún más el genoma de los virus involucrados en los casos de TVP. Se estudiaron por NGS ocho muestras de proventrículos de TVP y en todas se encontraron secuencias parciales o completas del Segmento B de CPNV, confirmando además la participación de este virus en casos clínicos de TVP. Sin embargo, en cinco de los casos, se encontraron secuencias parciales de adenovirus aviar A, en particular los dos casos en los que se habían observado viriones intranucleares mediante TEM. Estos resultados confirman la hipótesis de que el adenovirus A aviar puede estar presente en casos clínicos de TVP, aunque su papel en el desarrollo de la enfermedad requiere más estudios.

Transmissible Viral Proventriculitis (TVP) is an emergent viral infectious disease that affects mainly broiler chickens. It is characterized by impaired feed digestion, poor growth, and poor feed conversion rate, causing economic losses to the poultry industry. Enlargement, thickening, fragility, and paleness of the proventriculus, together with weakness and dilation of gastric isthmus is observed in TVP cases. Although proventricular gross lesions could be indicative of TVP, they are not specific. The disease is characterized by its histologic lesions: necrosis of oxynticopeptic cells, inflammation with a predominance of lymphocytes, and replacement of glandular epithelium by hyperplasic ductal epithelium. Therefore, the main objective of this thesis was to determine the presence of the disease and the new viral agent in Spanish poultry farms and further characterize this viral agent by ultrastructural studies and next generation sequencing techniques.

In the first study, the presence of CPNV in TVP clinical cases from Spanish poultry farms was retrospectively evaluated from 1999 to 2019 in FFPE proventricular tissue. Histopathological examination, CPNV RT-PCR, and partial sequence genome of positive cases obtained using Sanger sequence was carried out in 42 clinical cases. In adition, a new ISH technique was set up as a new method to detect the virus. The study identified the presence of CPNV in Spanish chicken farms since at least 1999. Moreover, ten proventriculi from seven different clinical cases were positive to CPNV RT-PCR and ISH, and all of them showed the characteristic histopathological features of TVP (necrosis of oxynticopeptic cells and gland interstitial inflammation). Phylogenetic studies showed that the Spanish CPNV partial sequences were very closely related to the available UK and USA CPNV sequences.

The second study of this thesis aimed to identify, visualize, and localize the causative agent of TVP by using TEM. Proventricular samples from twelve different clinical cases were used. Eight of the samples were positive by RT-PCR and ISH to CPNV, while the other three, although showing gross and microscopic lesiosn consistent with TVP, were negative to CPNV ISH and RT-PCR. Icosahedral, 70 nm, non-enveloped, intranuclear and/or intracytoplasm viruses were observed in four samples. Two of these samples were negative to CPNV by molecular methods, while the other two gave positive results to RT-PCR and ISH CPNV techniques. These results, together with the finding of virions in the nuclei of infecetd cells, a finding which is not usually seen in RNA viruses, raised the question whether TVP could also be caused by another viral agent simultaneoulsy or without the contribution fo CPNV.

To further undesrtand this last hypothesis, a third study was done to further characterize the genome of the virus/es involved in the TVP cases. Eight TVP proventriculi samples were studied by NGS and partial or complete sequences of CPNV Segment B were found in all of them, furter confirming the involvement of this virus in TVP clinical cases. However, in five of the cases, partial sequences of Avian adenovirus A were found, particularly the two cases where intranuclear virions had been observed by TEM. These results confirm the hypothesis that Avian adenovirus A can be present in TVP clinical cases, although its role in the development of the disease needs further studies.