Formation, transformation and inhibition of calcium oxalate nephroliths: in vitro studies and speciation by synchrotron radiation techniques

Abstract

Nefrolitiasis es una enfermedad dolorosa causada por la formación de piedras en el riñón. Tiene una incidencia en torno al 5-12% y una recurrencia con una tasa recaída del 50% en 5 años y 80-90% en 10 años, generando un coste de millones de euros al sistema de salud. Las piedras del riñón se clasifican en siete grupos mayoritarios según las directrices del análisis morfoconstitutcional, donde las piedras de oxalato de calcio, considerando tanto la especie mono- (COM) como la dihidratada (COD), representan el 60-70%, siendo el grupo más prevalente. No obstante, debido a su baja estabilidad, COD sufre una conversión cristalina (transformación) a COM, que es la especie termodinámicamente estable. Por consiguiente, el oxalato de calcio monohidratado en los cálculos renales puede ser formado directamente como COM o como el producto resultante tras la transformación del COD (denominado en este trabajo TRA). Estas diferencias en el origen de formación están relacionadas con diferentes patologías, por ejemplo, COM está generalmente relacionado con hiperoxaluria mientras que COD lo está con hipercalciuria.

El objetivo del trabajo multidisciplinar presentado en esta Tesis es entender las bases tras la formación, conversión cristalina e inhibición de los nefrolitos compuestos por oxalato de calcio mediante la aplicación de estudios in vitro, así como la determinación de la especiación de éstas especias, en los cálculos renales, mediante el uso de técnicas con radiación sincrotrón. Para conseguir dicho objetivo principal, el trabajo se presenta en seis estudios:

1. La caracterización de hidratos de calcio sintéticos mediante difracción de rayos X (XRD), absorción de rayos X (XAS) y espectroscopia infrarroja (IR) y raman, así como la aplicación de estudios computacionales de teoría funcional de la densidad (DFT), proporcionando así los parámetros apropiados que se requieren para monitorizar y caracterizar el proceso de transformación del COD.

2. Determinación de la distribución de la materia orgánica (proteínas y lípidos) a lo largo de los cálculos oxalocálcicos mediante microespectroscopia infrarroja basada en radiación sincrotrón, con el objetivo de establecer su papel como promotores o inhibidores en la formación de las piedras, así como su participación en la estabilización de COD.

3. Distinguir el origen de formación del oxalato de calcio monohidratado en piedras con la aplicación microdifracción basada en radiación sincrotrón, resolviéndolo mediante el análisis de los patrones de difracción 2D y su correlación con los niveles de textura de COM y TRA.

4. Estudiar el efecto de inhibidores comúnmente presentes en la orina en la conversión cristalina de COD mediante incubaciones in vitro en medios sintéticos que contienen citrato, magnesio, fosfato o fitato, así como sus combinaciones con calcio, lo que ayudará a entender mejor la transformación de COD y los procesos de estabilización en la orina.

5. Desarrollo de un nuevo índice de riesgo rápido y asequible, Capacidad Inhibidora de la Orina (UIC), el cual está relacionado con la capacidad de los inhibidores presentes en la orina de interactuar con los promotores y evitar la formación de cristales de oxalato de calcio. Está presentado en comparación con la Supersaturación Relativa (RSS) ya que ésta presenta dos grandes inconvenientes: la cantidad de trabajo analítico que se requiere para calcularlo, y la amplia “zona gris” de valores que comprenden los formadores de cálculos y los sujetos sanos (rango de datos que comprende ambos grupos).

6. Estudio de las propiedades antioxidantes y el efecto de diferentes fracciones de extracto de una planta tradicionalmente usada como “rompedora” de cálculos renales y diurética en las Islas Canarias, Lepidium latifolium L., también conocida como “rompepiedras”, en la formación de oxalatos de calcio. Con los resultados preliminares, los extractos derivados de esta planta podrían ser considerados como un tratamiento potencial de las piedras de riñón oxalocálcicas.

Nephrolithiasis is a painful disease caused by calculi formation in the kidney. It has an incidence of around 5-12% and a recurrence with a relapse rate of 50% in 5 years and 80-90% in 10 years, generating millions of euros per year of expenses for the health care system. Kidney stones are classified into seven major groups by morpho-constitutional analysis guidelines, where calcium oxalate stones, considering both the mono- (COM) and the dihydrated (COD) species, represents around 60-70%, being the most prevalent type. However, due to its low stability, COD suffers a crystalline conversion (transformation) into COM, which is the thermodynamically stable species. Hence, calcium oxalate monohydrate in renal calculi can be either formed directly as COM or as the resulting product after the transformation from COD (hereafter named TRA). These different formation origins are related with different pathologies, for example, COM is usually related to hyperoxaluria while COD is related to hypercalciuria.

The aim of the multidisciplinary work presented in this Thesis Dissertation is to understand the basis behind the stone formation, crystalline conversion and inhibition of calcium oxalate nephroliths by the application of in vitro studies, as well as to determine the speciation of these species, in the renal calculi by using synchrotron radiation based techniques. To achieve the main goal, the work is presented in six studies:

1. The characterization of synthetic calcium oxalate hydrates by X-ray diffraction (XRD), X-ray absorption spectroscopy (XAS), infrared (IR) and raman spectroscopy, and the application of a density functional theory (DFT) computational study with the objective of performing an unambiguous assignment of the vibrations, thus providing the appropriate parameters required to monitor and characterize the COD transformation process.

2. Determination of organic matter (proteins and lipids) distribution along the oxalocalcic calculi by synchrotron-based IR microspectroscopy, in order to stablish their role as promoters or inhibitors in the stone formation, as well as their participation in the stabilization of COD.

3. Distinguish the formation origin of calcium oxalate monohydrate in stones with the application of synchrotron microdiffraction, resolving it with the analysis of the 2D diffraction patterns and its correlation with the level of texture of COM and TRA.

4. Study the effect of common urine inhibitors in the COD crystalline conversion by in vitro incubations in synthetic media containing citrate, magnesium, phosphate or phytate, and their combinations with calcium, which will help to better understand the COD transformation and stabilization processes in urine.

5. Development of a new fast and affordable risk index, Urine Inhibitory Capacity (UIC), which is related with the capacity of the urine inhibitors to interact with the promoters and avoid the formation of calcium oxalate crystals. It is presented in comparison with the Relative Supersaturation (RSS) since it presents a two major drawbacks: the amount of analytical work required to determine it and the wide “grey zone” of values between stone formers and healthy subjects (range of data that comprehend both groups).

6. Study of the antioxidative properties and the effect of different extract fractions from a plant traditionally used as kidney stone breaker and diuretic on the Canary Islands, Lepidium latifolium L., also known as “rompepiedras” (“stone breaker”), on the calcium oxalate formation. With the preliminary results, the extracts derived from this plant could be considered as a potential treatment and/or prevention of oxalocalcic kidney stones.