The RING domain of Nse1: roles in Smc5/6 complex stability and genome integrity in human cells

Abstract

El complex Smc5/6, és un dels tres complexos de manteniment de l’estructura dels cromosomes (Structural Maintenance of Chromosomes, SMC). En aquest treball de tesi es mostra que el domini RING de la subunitat Nse1 del complex Smc5/6, té un paper crucial en el manteniment de l’estabilitat genòmica en cèl·lules humanes. Mitjançant CRISPR-Cas9 hem creat mutants estables de NSE1 en el domini RING C-terminal en cèl·lules HEK293T. En aquests mutants no es detecta la proteïna Nse1, ni altres subunitats del complex. A més, presenten un fenotip d’inestabilitat genòmica, caracteritzat per un creixement lent, mitosis més prolongades en el temps, dany endogen en el DNA, un alentiment en la progressió de les forquilles de replicació i sensibilitat a l’agent genotòxic MMS. Els nostres resultats suggereixen que els mutants en NSE1 entren en mitosis amb la presència de zones del DNA no replicades o amb estructures de recombinació no resoltes, que porten al trencament de cromosomes i a inestabilitat genòmica en la següent generació.

El complejo Smc5/6, es uno de los tres complejos de mantenimiento de la estructura de los cromosomas (Structural Maintenance of Chromosomes, SMC). En esta tesis se muestra que el dominio RING de la subunidad Nse1 del complejo Smc5/6, tiene un papel crucial en el mantenimiento de la estabilidad genómica en células humanas. Mediante CRISPR-Cas9 hemos creado mutantes estables de NSE1 en el dominio RING C-terminal, en células HEK293T. En estos mutantes no se detecta la proteína Nse1, ni otras subunidades del complejo. Además, presentan un fenotipo de inestabilidad genómica, caracterizado por un crecimiento lento, mitosis más prolongadas, daño endógeno en el ADN, ralentización en la progresión de las horquillas de replicación y sensibilidad a el agente genotóxico MMS. Estos resultados sugieren que los mutantes en NSE1 entran en mitosis con la presencia de zonas del DNA no replicadas o con estructuras de recombinación no resueltas, que llevan a la rotura de cromosomas y a inestabilidad genómica en la siguiente generación.

The Smc5/6 complex is one of the three Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) complexes. This thesis shows that the RING domain of the Nse1 subunit of the Smc5/6 complex plays a crucial role in maintaining genomic stability in human cells. Using CRISPR-Cas9 we created stable mutants of NSE1 in the C-terminal RING domain, in HEK293T cells. Nse1 protein and other subunits of the complex are not detected in these mutants. In addition, they present a phenotype of genomic instability, characterized by slow growth, prolonged mitosis, endogenous DNA damage, slowing in the progression of replication forks and sensitivity to the genotoxic agent MMS. These results suggest that mutants in NSE1 enter mitosis with the presence of unreplicated DNA regions or with unresolved recombination structures, leading to chromosome breakage and genomic instability, in the next generation.