Human Primary Organoid-Derived Epithelial Monolayers as a Novel Strategy for the Study of Adherent Invasive Escherichia coli pathogenicity and the effects of Postbiotics on Intestinal Epithelial Function

Abstract

Inflammatory bowel disorders – such as Inflammatory Bowel Disease (IBD) – are rising worldwide. A well-known feature of IBD is dysbiosis of the gut microbiota, characterized by a significant reduction of beneficial strains and a sharp increase in facultative anaerobes, as is the case of Adherent Invasive E. coli (AIEC). Even though the implication of the microbiota in persistent inflammation has been studied for years, a direct causal relationship between dysbiosis and IBD has not been established. To date, several strategies, such as the use of probiotics, have been proposed to counteract the microbial imbalance. Nevertheless, probiotics are thought to impair the return of the indigenous microbiome, and to aggravate inflammation in immune compromised patients. Recently, postbiotics – bacterial-free metabolites secreted by probiotic strains – have been proposed as a better and safer strategy to counterbalance the effects of intestinal inflammation. The intestinal epithelium is the first layer the luminal bacteria interact with. It is composed by a thin monolayer of cells that form a protective barrier against potential detrimental antigens along the whole gut. Thus, the study of epithelial responses to bacteria or their derived metabolites is of great importance to understand intestinal health and disease. Recent advances in the use of primary epithelial cell culture using freshly isolated human intestinal crypts as starting material offers a more faithful representation of the human gut compared to immortalized cell lines. In the first study of this thesis, we describe for the first time the use of a primary epithelial bidimensional (2D) model derived from 3D organoid cultures as a successful tool to study AIEC infection and its effects on the host epithelium at early and extended infection periods. We proved that this ex vivo culture adopts an appropriate cell polarization and orientation, thus becoming a promising resource to study the interactions of the luminal content with host epithelial cells. Importantly, we showed a strain and time-specific response of primary human intestinal epithelial cells when infected with AIEC and non-AIEC strains thus supporting the use of our system to study the functional consequences of AIEC infection on the intestinal epithelium. This 2D primary cell culture system derived from intestinal organoids was also employed in the second part of this thesis to explore the putative beneficial properties of postbiotics in the epithelial response to inflammatory stimuli. Transcriptomic analysis of 2D cultures pre- treated with postbiotics points towards an effect of the metabolite-cocktail in reverting the inflammatory status of the intestinal epithelium.

Moreover, postbiotics induced the differential expression of several genes on intact primary epithelial cells, demonstrating their potential in contributing to maintenance of homeostasis.

Overall, the human primary organoid-derived monolayer provides a promising tool for elucidating the potentially detrimental or beneficial mechanisms underlying the crosstalk of bacteria and its metabolites with the intestinal epithelium. Moreover, the capacity of this culture to respond and mimic the pro-inflammatory environment in vitro, may expand its use in modeling bacteria-host interactions in the context of intestinal inflammatory disorders, such as IBD.

Los trastornos inflamatorios intestinales, como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), están aumentando en todo el mundo. Un rasgo muy conocido de la EII es la disbiosis de la microbiota intestinal, caracterizada por una reducción significativa de las cepas beneficiosas y un fuerte aumento de los anaerobios facultativos, como es el caso de la E. coli Adherente Invasiva (AIEC). Aunque la implicación de la microbiota en la inflamación persistente se ha estudiado durante años, no se ha establecido una relación causal directa entre la disbiosis y la EII. Hasta la fecha, se han propuesto varias estrategias, como el uso de probióticos, para contrarrestar el desbalance microbiano. Sin embargo, se cree que los probióticos perjudican el retorno del microbioma autóctono y pueden agravar la inflamación en los pacientes inmunocomprometidos. Recientemente, los postbióticos – metabolitos libres de bacterias secretados por cepas probióticas – se han propuesto como una mejor y más segura estrategia para mitigar los efectos de la inflamación intestinal. El epitelio intestinal es la primera capa con la que interactúan las bacterias del lumen intestinal. Éste está compuesto por una fina monocapa de células que forman una barrera protectora, a lo largo de todo el intestino, contra posibles antígenos perjudiciales. Por ello, el estudio de las respuestas del epitelio a las bacterias o a sus metabolitos es de gran importancia para comprender la función intestinal en un estado tanto saludable como de inflamación. Los recientes avances en el uso de cultivos primarios de células epiteliales utilizando células derivadas de criptas intestinales humanas como material de partida, ofrecen una representación más fiel del intestino humano en comparación con las líneas celulares inmortalizadas. En el primer estudio de esta tesis, describimos por primera vez el uso de un modelo de epitelio intestinal en conformación bidimensional (2D) derivado de organoides intestinales como herramienta para estudiar la infección por AIEC así como sus efectos en el epitelio del huésped en períodos de infección tempranos y prolongados. Demostramos que este cultivo ex vivo adopta una polarización y orientación celular adecuadas, convirtiéndose así en un recurso prometedor para estudiar las interacciones del contenido del lumen intestinal con las células epiteliales del huésped. Es importante destacar que mostramos una respuesta de las células epiteliales primarias del intestino humano que es específica de la cepa empleada (AIEC o no-AIEC) y del tiempo de infección. Estos resultados dan soporte al uso de nuestro sistema para estudiar las consecuencias funcionales de la infección por AIEC en el epitelio intestinal.

Este sistema de cultivo celular primario 2D derivado de organoides intestinales también se empleó en la segunda parte de esta tesis para explorar las supuestas propiedades beneficiosas de los postbióticos en la respuesta del epitelio a varios estímulos inflamatorios. El análisis transcriptómico de los cultivos 2D pre-tratados con postbióticos apunta a un efecto del cóctel de metabolitos en la reversión del estado inflamatorio del epitelio intestinal. Además, los postbióticos indujeron la expresión diferencial de varios genes en las células epiteliales primarias intactas, demostrando su potencial para contribuir al mantenimiento de la homeostasis intestinal.

En general, el cultivo primario en monocapa derivado de organoides humanos constituye una herramienta prometedora para dilucidar los mecanismos potencialmente perjudiciales o beneficiosos que subyacen a la interacción de las bacterias y sus metabolitos con el epitelio intestinal. Además, la capacidad de este cultivo para responder y simular el entorno pro- inflamatorio in vitro, puede ampliar su uso en la modelización de las interacciones bacteria- huésped en el contexto de los trastornos inflamatorios intestinales, como la EII.

Els trastorns inflamatoris intestinals, com la malaltia inflamatòria intestinal (MII), estan augmentant a tot el món. Un tret molt conegut de la MII és la disbiosis de la microbiota intestinal, caracteritzada per una reducció significativa de les soques beneficioses i un fort augment dels anaerobis facultatius, com és el cas de l'E. coli Adherent Invasiva (AIEC). Encara que la implicació de la microbiota en la inflamació persistent s'ha estudiat durant anys, no s'ha establert una relació causal directa entre la disbiosis i la MII. Fins avui, diverses estratègies tals com l'ús de probiòtics, han estat proposades per intentar contrarestar el desequilibri microbià. No obstant això, es creu que els probiòtics perjudiquen el retorn del microbioma autòcton i agreugen la inflamació en els pacients immuno-compromesos. Recentment, els postbiòtics – metabòlits lliures de bacteris secretats per soques probiòtiques – s'han proposat com una millor i més segura estratègia per a mitigar els efectes de la inflamació intestinal. L'epiteli intestinal és la primera capa amb la qual interactuen els bacteris de la llum intestinal. Aquest està composat per una fina monocapa de cèl·lules que formen una barrera protectora al llarg de tot l'intestí contra possibles antígens perjudicials. Per això, l'estudi de les respostes de l'epiteli als bacteris o als seus metabòlits és de gran importància per a comprendre la funció intestinal en un estat tant saludable com d’inflamació. Els recents avanços en el cultiu primari de cèl·lules epitelials utilitzant criptes intestinals humanes com a material de partida, ofereixen una representació més fidel de l'intestí humà en comparació amb les línies cel·lulars immortalitzades. En el primer estudi d'aquesta tesi, descrivim per primera vegada l'ús d'un model d'epiteli intestinal en conformació bidimensional (2D) derivat d’organoides intestinals com a eina per a estudiar la infecció per AIEC així com els seus efectes en l'epiteli de l'hoste en períodes d'infecció curts i prolongats. Demostrem que aquest cultiu ex vivo adopta una polarització i orientació cel·lular adequades, convertint-se així en un recurs prometedor per a l’estudi de les interaccions del contingut de la llum intestinal amb les cèl·lules epitelials de l'hoste. És important destacar que vam demostrar una resposta de les cèl·lules epitelials primàries de l'intestí humà específica de la soca emprada (AIEC o no-AIEC) i del temps d'infecció. Aquests resultats donen suport a l'ús del nostre sistema per estudiar les conseqüències funcionals de la infecció per AIEC en l'epiteli intestinal.

Aquest sistema de cultiu cel·lular primari 2D derivat d’organoides intestinals també es va emprar en la segona part d'aquesta tesi per tal d’explorar les suposades propietats beneficioses dels postbiòtics en la resposta de l'epiteli a diversos estímuls inflamatoris. L'anàlisi transcriptòmic dels cultius 2D pre-tractats amb postbiòtics apunta a un efecte del còctel de metabòlits en la reversió de l'estat inflamatori de l'epiteli intestinal. A més, els postbiòtics van induir l'expressió diferencial de diversos gens en les cèl·lules epitelials primàries intactes, demostrant el seu potencial per a contribuir al manteniment de l'homeòstasi.

En general, el cultiu primari en monocapa derivat d’organoides humans constitueix una eina prometedora per a dilucidar els mecanismes potencialment perjudicials o beneficiosos subjacents a la interacció dels bacteris i els seus metabòlits amb l'epiteli intestinal. A més, la capacitat d'aquest cultiu per a respondre i simular l'entorn pro-inflamatori in vitro, pot ampliar el seu ús en la modelització de les interaccions bacteri-hoste en el context dels trastorns inflamatoris intestinals, com la MII.