Elucidating the plant growth-promoting effects of three microorganisms on deciduous fruit tree plants using in vitro culture conditions

Abstract

El cultiu in vitro de teixits vegetals és una tècnica molt utilitzada per a l’obtenció d’importants quantitats de material genèticament idèntic i lliure de malalties. No obstant això, en alguns cultius de fruiters, aquesta tècnica es pot veure limitada per la baixa capacitat d’arrelament i aclimatació d’alguns genotips, així com per las grans pèrdues ocasionades per la presència de contaminacions endòfites. L’ús de microorganismes que milloren el creixement de plantes pot constituir una alternativa interessant gràcies a la seva capacitat de produir hormones vegetals i controlar el creixement de patògens. A més a més, també és important desenvolupar productes basats en aquests microorganismes per a l’escalat de la seva aplicació a camp. En aquesta tesi, els tres microorganismes Pseudomonas oryzihabitans PGP01, Cladosporium ramotenellum PGP02 i Phoma spp. PGP03 es van aïllar de cultius in vitro contaminats de Prunus i Pyrus que mostraven un millor creixement que els no contaminats. En plantes produïdes a partir d’embrions de nectarina rescatats in vitro (Capítol 1), es va demostrar que P. oryzihabitans PGP01 augmentava el desenvolupament radicular que afavoria la seva aclimatació en hivernacle. En portaempelts comercials micropropagats in vitro (Capítol 2), C. ramotenellum PGP02 i Phoma spp. PGP03 milloraven el percentatge d’arrelament in vitro, d’un 56,3% a un 100%, en explants tractats amb IBA del portaempelt difícil d’arrelar Py12. En el mateix capítol, P. oryzihabitans PGP01 també promogué el desenvolupament de les arrels del porta-empelt de Prunus RP-20. Tots aquests resultats podrien estar relacionats amb la producció de IAA per part dels tres microorganismes. Mitjançant l’ús de mutants d’Arabidopsis thaliana, es va suggerir que les modificacions en les arrels induïdes per P. oryzihabitans PGP01 podrien estar mediades per les estrigolactones (SLs) i el glutatió (GSH) (Capítol 3). En un cultiu en medi líquid (Capítol 4), es va observar que els efectes en les arrels produïts per P. oryzihabitans PGP01 podrien estar mediats pel contingut d’auxines en el medi de cultiu. A més a més, utilitzant aquest mateix sistema, en presencia de C. ramotenellum PGP02, es va suggerir un efecte del baix pH en el medi de cultiu sobre el creixement d’endòfits en plantes de RP-20. Aquesta hipòtesi va quedar demostrada al Capítol 5, verificant que un pH àcid, en absència de microorganismes, reduïa la concentració d’endòfits sense afectar la multiplicació in vitro. Finalment, es van provar tres subproductes de la industria de la patata, tomàquet i cereals per a l’elaboració d’ún medi de cultiu barato per la producció de P. oryzihabitans PGP01. El creixement d’aquest bacteri en un medi basat en subproductes de patata es va obtenir un creixement màxim de 4.4x109 UFC mL-1 sense afectar la seva activitat biològica (Capítol 6). Els resultats obtinguts aporten noves aproximacions sobre l’ús de microorganismes beneficiosos com alternatives més sostenibles per a promoure el creixement de plantes in vitro.

El cultivo in vitro de tejidos vegetales es una técnica muy útil para obtener grandes cantidades de material genéticamente idéntico y libre de enfermedades. Sin embargo, esta técnica se ve limitada en algunas plantas frutales por la poca capacidad de enraizamiento y aclimatación de algunos genotipos, o por las pérdidas de material vegetal causadas por la presencia de contaminaciones endófitas. El uso de microorganismos que mejoran el crecimiento de plantas puede ser una alternativa muy interesante debido a su capacidad de producir hormonas vegetales o de controlar el crecimiento de patógenos. Es importante desarrollar productos basados en estos microorganismos para escalar su posible aplicación en campo. Los tres microorganismos Pseudomonas oryzihabitans PGP01, Cladosporium ramotenellum PGP02 y Phoma spp. PGP03 se aislaron de cultivos in vitro contaminados de Prunus y Pyrus que mostraban un mayor crecimiento que los no contaminados. En plántulas obtenidas a partir de embriones de nectarina rescatados in vitro (Capítulo 1), P.oryzihabitans PGP01 indujo mayor desarrollo radicular que favoreció la aclimatación de las plantas en invernadero. En patrones comerciales micropropagados in vitro (Capítulo 2), C. ramotenellum PGP02 y Phoma spp. PGP03 mejoraron el porcentaje de enraizamiento in vitro, de un 56.3 a un 100%, de explantos tratados con IBA del portainjerto Pyrus Py12 difícil de enraizar. En este mismo capítulo, P.oryzihabitans PGP01 también promovió el desarrollo de las raíces del patrón de Prunus RP-20. Todos estos resultados podrían estar relacionados con la producción de IAA por parte de los tres microorganismos. Utilizando mutantes de Arabidopsis thaliana, se sugirió que los efectos en las raíces producidos por P. oryzihabitans PGP01 podrían estar mediados por estrigolactonas (SLs) y glutatión (GSH) (Capítulo 3). En cultivo con medio líquido (Capítulo 4), se observó que los efectos en la raíz producidos por P. oryzihabitans PGP01 podrían estar mediados por el contenido de auxinas en el medio de cultivo. En este mismo sistema de crecimiento en líquido, en presencia de C. ramotenellum PGP02, se sugirió el efecto de un pH bajo en el medio de cultivo sobre el crecimiento de microorganismos endófitos en plantas de RP-20. Esta hipótesis fue finalmente confirmada en el Capítulo 5, demostrando que un pH ácido en ausencia de microorganismos reducía la concentración de endófitos sin afectar la micropropagación in vitro. Finalmente, se probaron tres subproductos de la industria de la patata, tomate y cereales para elaborar un medio barato para la producción de P. oryzihabitans PGP01. El crecimiento de esta bacteria en un medio basado en subproductos de patata proporcionó un crecimiento máximo de 4,4x109 UFC mL-1 sin afectar la actividad biológica del mismo (Capítulo 6). Los resultados presentados en esta tesis proporcionan hallazgos muy novedosos acerca del uso de microoganismos beneficiosos como alternativas más sostenibles para promover el crecimiento de plantas in vitro.

In vitro tissue culture constitutes a very versatile technique to obtain large amounts of true-to-type and disease-free-plant materials. However, in some fruit tree crops, the poor in vitro rooting or acclimatization of some genotypes, or the high losses of plant material associated to endophytic contaminations may limit the effectiveness of the process. The use of microorganisms with plant-growth promoting ability might represent a sustainable alternative to overcome those limitations, knowing their ability to produce plant hormones or control pathogens growth. On the other hand, for the scale-up of the application to field conditions, it is of crucial importance to develop a product based on microorganism showing potential agronomical interest. The three microorganisms Pseudomonas oryzihabitans PGP01, Cladosporium ramotenellum PGP02 and Phoma spp. PGP03 were isolated from Prunus and Pyrus contaminated in vitro cultures showing a greater growth than those non-contaminated. In seedlings obtained from in vitro nectarine rescued embryos (Chapter 1), P. oryzihabitans PGP01 promoted root development, favouring the acclimatization to greenhouse conditions. In in vitro micropropagated commercial rootstocks (Chapter 2), C. ramotenellum PGP02 and Phoma spp. PGP03 increased the in vitro rooting percentage, from 56.3 to 100%, of the hard-to-root Pyrus rootstock Py12 explants treated with 3-indolebutyric acid. An effect of P. oryzihabitans PGP01 on root development of the Prunus rootstock RP-20 was observed. The in vitro ability of the three microorganisms to produce IAA supported these results. Using Arabidopsis thaliana defective mutants, the role of strigolactones (SLs) and glutathione (GSH) in the root events induced by P. oryzihabitans PGP01 was suggested (Chapter 3). In a liquid culture (Chapter 4), it was established a link between auxin levels in the medium and root development in the presence of P. oryzihabitans PGP01. Furthermore and regarding endophytes growth in the culture medium, the role of acidic pH to control their growth in RP-20 cultures was suggested in the presence of C. ramotenellum PGP02, being this assumption finally confirmed in Chapter 5 in the absence of microorganisms. In this chapter, the micropropagation at low pH reduced endophytes population without affecting in vitro micropropagation. Finally, wastes based on potato, tomato and cereals industries were tested for the development of a cheap culture medium for P. oryzihabitans PGP01. The growth of this bacterium in a potato wastes-based medium provided a maximum of 4.4x109 CFU mL-1 without losing the plant growth-promoting activity (Chapter 6). The results obtained in the present thesis provide novel insights regarding the use of beneficial microorganisms as more sustainable alternatives to promote in vitro plant growth.