Drug discovery with a FRET Biosensor of scaffolding interactions in the N-terminal region of c-Src = Descubrimiento de fármacos mediante un biosensor basado en FRET sensible a las interacciones en la región N-terminal de c-Src

Abstract

c-Src tyrosine kinase is associated with poor prognosis in many cancer processes. Although inhibitors of c-Src kinase activity are known, they have not reached success in clinical trials because of lack of selectivity or interference with c-Src physiological activity in non-cancer cells.

The Src N-terminal regulatory element (SNRE) is responsible for c-Src proper response to its environment. At its heart there is a fuzzy complex involving the intrinsically disordered SH4 and Unique domain, as well as the SH3 domain.

Mutations in the Unique domain decrease the cancer-promoting activity of c-Src. In order to find drugs having ana analogous effect, in this thesis we developed a FRET fluorescence-based sensor to detect perturbations in the fuzzy complex and carry out a high-throughput analysis of a customized chemical library including FDA-approved drugs that could eventually be used for repurposing.

The thesis describes the design and characterization of the sensor, the description of the screening process, including robotic based preparation of the screening plates as well as the analysis of the data.

The result from the screening was the detection of hits that are currently being used in the clinic for other diseases but were not identified as anticancer drugs. The hits were further analyzed used NMR, dynamic light scattering, and toxicity analysis in various cell lines with promising results, although they require additional confirmation.

En las últimas décadas las proteínas intrínsecamente desordenadas han demostrado tener una relevancia vital en muchos procesos biológicos. La proteína c-Src está involucrada en numerosos procesos de señalización celular y se ha descubierto que la región desordenada de c-Src (dominios SH4 y Único) tiene función regulatoria y que su mala prognosis está relacionada con cáncer de próstata entre otros.

Los dominios SH4 y Único, interaccionan con el SH3 y bicapas lipídicas, sugiriendo la posibilidad de ser esenciales en la buena regulación de procesos biológicos. En esta tesis nos planteamos el diseño de un sensor basado en fluorescencia FRET (“Förster Ressonance Energy Transfer”) para hacer un cribaje masivo de compuestos y encontrar alguno que interactué con esta región intrínsecamente desordenada de c-Src. Utilizando proteínas fluorescentes rojas (mCherry y mRuby3) y verdes (GFP y mClover3) creamos un biosensor prototipo y uno definitivo capaz de tener una respuesta de FRET este consistía en unir en N-t y C-terminal una GFP (“green fluorescent protein”) y una RFP (“red fluroescent protein”) donde tendríamos los dominios SH4, Único y SH3 de c-Src, esperando que la formación de “fuzzy complex” de esta región promoviera la interacción de las proteinas produciendo FRET. En el prototipo inicial (Rover, constituido por mCherry-SH4-Único-SH3-GFP) se realizaron estudios de concentración, temperatura y efecto del péptido VSL12 para caracterización mediante fluorescencia, también se realizó un estudio de RMN, observando una baja señal FRET pasamos a diseñar un nuevo biosensor más eficiente. Para el diseño final utilizado en el cribado (CLOBY, constituido por mClover3-SH4- Único-SH3-mRuby3) se realizaron estudios ambientales, fuerza iónica, pH y fosforilación para después pasar a encontrar la concentración optima de trabajo, finalmente se estudió la proteína mediante RMN, también se añadió una zona de corte entre la región N-terminal de c-Src y mClover para tener controles internos más eficaces. Se pasó a realizar un cribado de 1690 compuestos obtenidos de la combinación de 2 bibliotecas de compuestos, una biblioteca de compuestos aprobados por la FDA y otra de compuestos anti-cancerígenos. Tras un cribado inicial se seleccionaron 272 compuestos que se estudiaron en un segundo cribado a 3 concentraciones diferentes, finalmente se redujo la biblioteca a 10 compuestos seleccionados más 30 que no habían podido medirse en los cribados previos. Estos 10 compuestos seleccionados se estudiaron individualmente por fluorescencia y por RMN observando que habían compuestos que interactuaban con las proteínas fluorescentes y otro con la región N-terminal de c-Src. Los 30 compuestos que no habían podido ser estudiados en los cribados, se estudiaron de manera individual por fluorescencia y junto a los diez iniciales se hizo una selección de 10 compuestos a estudiar en diferentes líneas celulares sobretodo de cáncer de mama y mieloma múltiple. Finalmente encontramos 2 compuestos que tenían actividad tanto por fluorescencia como por células que siguieren la posibilidad de un nuevo camino en el descubrimiento de fármacos de unión a proteínas intrínsecamente desordenadas.