Development and characterization of protein nanoformulations as alternative therapeutics to reduce antibiotic usage

Abstract

L’aparició de farmacoresistència bacteriana als antibiòtics convencionals és una situació d’alarma mundial. Aquest escenari ha obligat a implementar mesures com la millora de les pràctiques d’higiene o l’administració controlada d’antibiòtics per reduir el seu ús en totes les àrees en les que s’utilitzen comunament, inclosa la medicina humana i animal i la indústria animal de producció d’aliments . Totes aquestes mesures estan destinades a disminuir l’aparició i propagació de la resistència als antibiòtics entre els bacteris, però quan es tracta de combatre als bacteris que ja presenten una o múltiples resistències, es necessiten amb urgència alternatives als antibiòtics. En aquest context, s’han proposat diferents estratègies, entre les quals s’inclouen l’ús de citoquines i pèptids antimicrobians (AMPs). Les citoquines són petites proteïnes reguladores intercel·lulars que tenen un paper central en l’inici, manteniment i regulació de la resposta immune innata. Concretament, l’IFN-γ té un paper fonamental en la promoció de la immunitat protectora contra les infeccions. D’altra banda, els AMPs, com GWH1, són generalment petits pèptids catiònics de naturalesa amfipàtica que tenen activitats antibacterianes, antifúngiques i antivirals d’ampli espectre, la capacitat de modular la resposta immune de l’hoste i una possibilitat reduïda d’induir resistència bacteriana. Malgrat el seu potencial com a agents antiinfecciosos, les citoquines i els AMPs estan subjectes a diversos desavantatges que s’han d’abordar abans de la seva possible aplicació biomèdica. En particular, la baixa estabilitat és un inconvenient comú associat a aquest tipus de compostos proteics. En aquest sentit, s’han aplicat diferents estratègies per superar aquesta limitació i millorar l’eficàcia d’aquests fàrmacs després de la seva administració. La majoria d’aquestes estratègies consisteixen en la vehicularización d’aquestes proteïnes o pèptids en estructures superiors, proporcionant un entorn protector i permetent la possibilitat d’alliberar-los en localitzacions concretes. La formació d’aquestes estructures pot ser modulada a través d’un disseny racional sobre el gen de la proteïna recombinant, com, per exemple, la incorporació de certs pèptids en l’estructura de la proteïna per generar components individuals amb capacitat autoensamblant (nanopartícules solubles), o per obtenir proteïnes propenses a l’agregació (cossos d’inclusió -IBs-). Encara que aparentment diferents, tots aquests complexos s’originen a partir d’interaccions proteiques impulsades per factors termodinàmics i cinètics similars que finalment condueixen a la formació de diferents formats de proteïnes; arranjaments estructurals superiors que involucren a través d’interaccions dirigides o no dirigides, la convergència de formes proteiques aïllades. En aquesta tesi s’ha caracteritzat i avaluat la nanoformulación d’aquestes molècules (citocines i AMPs) en diferents formats proteics incloent IBs i nanopartícules solubles autoensamblants amb l’objectiu de desenvolupar alternatives terapèutiques als antibiòtics. A més, s’ha llançat una mica de llum sobre les forces que governen el procés d’agregació i com es pot modular per promoure la formació d’aquests IBs.

La aparición de farmacorresistencia bacteriana a los antibióticos convencionales es una situación de alarma mundial. Este escenario ha obligado a implementar medidas como la mejora de las prácticas de higiene o la administración controlada de antibióticos para reducir su uso en todas las áreas en las que se utilizan comúnmente, incluida la medicina humana y animal y la industria animal de producción de alimentos. Todas estas medidas están destinadas a disminuir la aparición y propagación de la resistencia a los antibióticos entre las bacterias, pero cuando se trata de combatir a las bacterias que ya presentan una o múltiples resistencias, se necesitan con urgencia alternativas a los antibióticos. En este contexto, se han propuesto diferentes estrategias, entre las que se incluyen el uso de citoquinas y péptidos antimicrobianos (AMPs). Las citoquinas son pequeñas proteínas reguladoras intercelulares que desempeñan un papel central en el inicio, mantenimiento y regulación de la respuesta inmune innata. Concretamente, el IFN-γ tiene un papel fundamental en la promoción de la inmunidad protectora contra las infecciones. Por otro lado, los AMPs, como GWH1, son generalmente pequeños péptidos catiónicos de naturaleza anfipática que tienen actividades antibacterianas, antifúngicas y antivirales de amplio espectro, la capacidad de modular la respuesta inmune del huésped y una posibilidad reducida de inducir resistencia bacteriana. A pesar de su potencial como agentes antiinfecciosos, las citoquinas y los AMPs están sujetos a varias desventajas que deben abordarse antes de su posible aplicación biomédica. En particular, la baja estabilidad es un inconveniente común asociado a este tipo de compuestos proteicos. En este sentido, se han aplicado diferentes estrategias para superar esta limitación y mejorar la eficacia de estos fármacos tras su administración. La mayoría de estas estrategias consisten en la vehicularización de estas proteínas o péptidos en estructuras superiores, proporcionando un entorno protector y permitiendo la posibilidad de liberarlos en localizaciones concretas. La formación de estas estructuras puede ser modulada a través de un diseño racional sobre el gen de la proteína recombinante, como, por ejemplo, la incorporación de ciertos péptidos en la estructura de la proteína para generar componentes individuales con capacidad autoensamblante (nanopartículas solubles), o para obtener proteínas propensas a la agregación (cuerpos de inclusión -IBs-). Aunque aparentemente diferentes, todos estos complejos se originan a partir de interacciones proteicas impulsadas por factores termodinámicos y cinéticos similares que finalmente conducen a la formación de diferentes formatos de proteínas; arreglos estructurales superiores que involucran a través de interacciones dirigidas o no dirigidas, la convergencia de formas proteicas aisladas. En esta tesis se ha caracterizado y evaluado la nanoformulación de estas moléculas (citoquinas y AMPs) en diferentes formatos proteicos incluyendo IBs y nanopartículas solubles autoensamblantes con el objetivo de desarrollar alternativas terapéuticas a los antibióticos. Además, se ha arrojado algo de luz sobre las fuerzas que gobiernan el proceso de agregación y cómo se puede modular para promover la formación de dichos IBs.

The emergence of bacterial drug resistance to conventional antibiotics is a global alarming situation. This worrying scenario has forced the implementation of measures such us improved hygiene practices or antibiotic stewardship to reduce antimicrobial usage in all areas in which these therapeutics are commonly used, including human and animal medicine and food-producing animal industry. All these measures are intended to diminish the appearance and spread of drug resistance among bacteria, but when it comes to combat against drug or multidrug resistant bacteria, alternatives to traditional antibiotics are urgently needed. In this context, different strategies have been proposed as promising alternatives to antibiotics, including the use of cytokines and antimicrobial peptides (AMPs). Cytokines are small intercellular regulatory proteins that play a central role in initiating, maintaining, and regulating the innate immune response. Specifically, IFN-γ has a pivotal role in promoting protective immunity against infections. On the other hand, AMPs such as GWH1, are generally small cationic peptides with an amphipathic nature that have a broad-spectrum antibacterial, antifungal and antiviral activities, the ability to modulate the host immune response and a reduced possibility of inducing bacterial drug resistance. Despite their potential as anti-infective agents, cytokines and AMPs are subjected to several disadvantages that must be addressed prior to their possible biomedical application. In particular, low stability is a common drawback associated to these type of protein compounds. In this sense, different technologies and strategies have been applied in order to overpass this limitation and improve the efficiency of these drugs after administration. Most of these strategies consist on the vehicularization of these proteins or peptides into superior complexes, providing a protective environment and allowing the possibility of deliver them to the target site. The formation of these superior structures may be modulated by a direct rational design over the recombinant protein gene, such as que incorporation of certain peptides into the protein structure to generate building blocks for spontaneous self-assembling (soluble nanoparticles), or to obtain prone-to-aggregate proteins (inclusion bodies -IBs-). Although seemingly different, these small-scale complexes all originate from fundamental protein interactions and are driven by similar thermodynamic and kinetic factors finally leading to the formation of different proteins formats; superior structural arrangements that involve through directed or not directed interactions, the convergence of isolated protein forms. In this thesis, the nanoformulation of these molecules (cytokines and AMPs) into different protein formats including IBs and soluble self-assembling nanoparticles have been characterized and evaluated with the aim to develop therapeutic alternatives to antibiotics. In addition, some light has been shed on the forces that govern the aggregation process and how it can be modulated to promote the formation of IBs.