Estudio de la interacción entre los marcadores de virulencia, perfil de resistencia y clones de alto riesgo en los modelos Caenorhabditis elegans y Galleria mellonella. Evaluación del valor predictivo como marcadores pronósticos en la bacteriemia por Pseudomonas aeruginosa

Abstract

[spa] Pseudomonas aeruginosa es un patógeno resistente a múltiples tipos de antibióticos. Esta cualidad ha favorecido en las últimas décadas el incremento de las infecciones nosocomiales provocadas por cepas MDR/XDR, siendo especialmente relevantes las causadas por los denominados clones de alto riesgo. Dichos clones se encuentran diseminados a nivel mundial y los más extendidos en el territorio nacional son los ST175, ST111 y ST235. Este patógeno posee además, múltiples factores de virulencia que contribuyen a la patogenia de las infecciones (motilidad, pigmentos, sistemas de secreción de toxinas, etc.). Se ha demostrado en estudios previos que la expresión de algunos de estos factores tales como la motilidad, producción de pigmentos y eficacia biológica, se halla disminuida en los clones de alto riesgo mencionados. Asimismo, se ha determinado una relación entre el perfil de resistencia, clones de alto riesgo y genotipo del SST3. En concreto, se ha propuesto el gen exoU del SST3 como factor relevante en la mortalidad en infecciones del torrente sanguíneo por P. aeruginosa. Además la presencia de este gen en el clon ST235, mostró una elevada patogenicidad en un modelo murino. Sin embargo, los modelos mamíferos no resultan útiles para el análisis de grandes colecciones. En este sentido, en las últimas décadas los modelos invertebrados han demostrado ser válidos para realizar este tipo de estudios, dada su simplicidad experimental, bajo coste y ausencia de limitaciones éticas. De acuerdo con lo anterior, el primer objetivo de este trabajo fue examinar si dicha interacción se cumplía en los modelos invertebrados de infección Caenorhabditis elegans y Galleria mellonella evaluando la virulencia de una colección de 140 aislados, para posteriormente determinar el valor predictivo de la letalidad en C. elegans como marcador pronóstico en la bacteriemia causada por P. aeruginosa. Los resultados obtenidos nos permitieron demostrar en el modelo de C. elegans una relación inversa y significativa entre la resistencia y virulencia de P. aeruginosa, mostrándose la virulencia más baja en los perfiles XDR. Sin embargo, la virulencia de los clones de alto riesgo MDR/XDR varió ampliamente, los ST111 y ST235 fueron virulentos, mientras que los ST175 mostraron una virulencia reducida. Aunque, la pérdida de virulencia no se pudo atribuir a ninguna mutación, la presencia de un polimorfismo en un gen se asoció con un aumento de esta. La elevada virulencia del ST235 se podría atribuir a la presencia de la toxina ExoU del SST3, también relacionada con una mayor virulencia en este modelo. Otros factores como la motilidad y la producción de pigmentos, no fueron esenciales para la virulencia en el modelo de C.elegans. Por lo que respecta al modelo de G. mellonella, también se documentó una relación inversa entre la resistencia y la virulencia. Al igual que en C. elegans, el ST175 mostró una virulencia variable, mientras que los ST111 y ST235 fueron virulentos; sin embargo, la variación de la virulencia del ST175, no se pudo atribuir a ningún cambio genético. El único factor de virulencia asociado con la letalidad de G. mellonella fue la motilidad. Mientras que los que se asociaron de forma independiente con la virulencia de P. aeruginosa fueron los perfiles ModR y MultiS, y la procedencia epidémica de los aislados. Como consecuencia de los resultados obtenidos en el modelo de C. elegans, y a fin de llevar a cabo el segundo objetivo basado en evaluar la virulencia en este modelo como indicador pronóstico; se amplió el estudio con 593 cepas de bacteriemia por P. aeruginosa. Los resultados indicaron que en C. elegans el fenotipo de virulencia se correlacionó con el perfil de resistencia, el genotipo del SST3 y con ciertas características clínicas de los pacientes; asociándose los fenotipos no virulentos con una mayor gravedad de la enfermedad. Sin embargo, no se observó una relación entre el fenotipo de virulencia y la mortalidad en pacientes, indicando que C. elegans no es un buen indicador pronóstico para este tipo de infecciones.

[cat] Pseudomonas aeruginosa és un patogen resistent a múltiples tipus d'antibiòtics. Aquesta qualitat ha afavorit a les darreres dècades l'increment de les infeccions nosocomials provocades per soques MDR/XDR, essent especialment rellevants les causades pels denominats clons d'alt risc. Aquests clons es troben disseminats a nivell mundial i els més estesos al territori nacional són els ST175, ST111 i ST235. Aquest patogen a més posseeix múltiples factors de virulència que contribueixen a la patogènia de les infeccions (motilitat, pigments, sistemes de secreció de toxines, etc.). S'ha demostrat en estudis previs que l'expressió d'alguns d'aquests factors com la motilitat, producció de pigments i l’eficàcia biològica, es troben disminuïdes als clons d'alt risc esmentats. També s'ha determinat una relació entre el perfil de resistència, clons d'alt risc i genotip del SST3. En particular, s'ha proposat el gen exoU del SST3 com a factor rellevant de mortalitat en infeccions del torrent sanguini per P. aeruginosa. A més la presència d'aquest gen al clon ST235, va mostrar una elevada patogenicitat a un model murí. No obstant això, els models mamífers no resulten útils per a l'anàlisi de grans col·leccions. En aquest sentit, durant les darreres dècades els models invertebrats han demostrat ser vàlids per a realitzar aquest tipus d'estudis, donada la seva simplicitat experimental, baix cost i absència de limitacions ètiques. D'acord amb l'exposat, el primer objectiu d'aquest treball va ser examinar si aquesta interacció es complia als models invertebrats d'infecció Caenorhabditis elegans i Galleria mellonella avaluant la virulència d'una col·lecció de 140 aïllats, per a posteriorment determinar el valor predictiu de la letalitat a C. elegans com a marcador pronòstic de la bacterièmia causada per P. aeruginosa. Els resultats obtinguts ens van permetre demostrar al model C. elegans una relació inversa i significativa entre la resistència i virulència de P. aeruginosa, mostrant-se la virulència més baixa als perfils XDR. No obstant això, la virulència dels clons d'alt risc MDR/XDR va variar àmpliament, els ST111 i ST235 van ser virulents, mentre que els ST175 van mostrar una virulència reduïda. Encara que la pèrdua de virulència no es va poder atribuir a cap mutació, la presència d'un polimorfisme a un gen es va associar amb un augment d'aquesta. L'elevada virulència del ST235 es podria atribuir a la presència de la toxina ExoU del SST3, també relacionada amb una major virulència en aquest model. Altres factors com la motilitat i la producció de pigments, no van ser essencials per a la virulència al model de C. elegans. Pel que respecta al model de G. mellonella, també es va documentar una relació inversa entre la resistència i la virulència. De la mateixa manera que a C. elegans, l'ST175 va mostrar una virulència variable, mentre que els ST111 i ST235 van ser virulents; no obstant això, la variació de la virulència del ST175, no es va poder atribuir a cap canvi genètic. L'únic factor de virulència associat amb la letalitat de G. mellonella va ser la motilitat. Mentre que els que es van associar de manera independent amb la virulència de P. aeruginosa van ser els perfils ModR i MultiS, i la procedència epidèmica dels aïllats. A conseqüència dels resultats obtinguts al model de C. elegans, i a fi de dur a terme el segon objectiu basat en avaluar la virulència en aquest model com a indicador pronòstic; es va ampliar l'estudi amb 593 soques de bacterièmia per P. aeruginosa. Els resultats van indicar que el fenotip de virulència a C. elegans es va correlacionar amb el perfil de resistència, el genotip del SST3 i amb certes característiques clíniques dels pacients; associant-se els fenotips no virulents amb una major gravetat de la malaltia. Tot i així, no es va observar una relació entre el fenotip de virulència i la mortalitat en pacients, indicant que C. elegans no és un bon indicador pronòstic per a aquesta mena d'infeccions.

[eng] Pseudomonas aeruginosa is a pathogen resistant to multiple types of antibiotics. Over the last decades this quality has led to an increase of nosocomial infections caused by MDR/XDR strains, being especially relevant those caused by so-called high-risk clones. These clones are spread worldwide, being ST175, ST111 and ST235 the most widespread nationally. This pathogen also has multiple virulence factors that contribute to the pathogenesis of infections (motility, pigments, toxin secretion systems, etc.). Previous studies have shown that high-risk clones mentioned above have been associated with a decrease of expression of motility, pigments, and fitness. In addition, a relationship between resistance profile, high-risk clones and T3SS genotype has been defined. Specifically, the T3SS exoU gene has been proposed as a relevant factor for mortality from P. aeruginosa bloodstream infections. Furthermore, in a murine model the presence of this gene in the ST235 clone was associated with high pathogenicity. However, mammalian models are not useful for the analysis of large collections. In this context, in recent decades, invertebrate models have proven to be valid for conducting these types of studies, given their experimental simplicity, low cost, and the absence of ethical issues. Accordingly, the first objective of this work was to examine whether this interaction was fulfilled in invertebrate infection models Caenorhabditis elegans and Galleria mellonella, evaluating the virulence of a 140 isolates collection, to subsequently evaluate the predictive value of lethality in C. elegans as a prognostic marker of bacteraemia caused by P. aeruginosa The results obtained allowed us to document in the C. elegans model a clear inverse relation between resistance and virulence of P. aeruginosa, showing the lowest virulence in the XDR profiles. However, virulence varied widely between high-risk clones MDR/XDR, as ST111 and ST235 were virulent, while ST175 were less so. Although, the loss of virulence could not be attributed to any mutation, the presence of a polymorphism in a gene was associated with increased virulence. The high virulence of ST235 could be attributed to the presence of the ExoU toxin in T3SS, related to the increased virulence in this model. Other factors, such as motility and pigment production, were not relevant for virulence in the C. elegans model. As regards the G.mellonella model, an inverse relationship between resistance and virulence was also documented. As in C. elegans model, ST175 showed variable virulence, while ST111 and ST235 clones were virulent; but, the variation in virulence of ST175 could not be attributed to any genetic change. Motility was the only virulence factor associated with the lethality of G. mellonella. While those independently associated with the virulence of P. aeruginosa were the ModR and MultiS profiles, and the epidemic origin of the isolates. As a consequence of the results obtained in C. elegans model, and in order to carry out the second objective which was to evaluate virulence in this model as a prognostic indicator, the study was extended with 593 P. aeruginosa bacteraemia strains. The results indicated that in C. elegans, the virulence phenotype was correlated with the resistance profile, the T3SS genotype and with certain clinical characteristics of the patients, with non-virulent phenotypes being associated with a greater severity of the disease. However, no relation was observed between virulence phenotype and patient’s mortality, indicating that C. elegans is not a good prognostic indicator for this type of infection.