Porcine circovirus 3 (PCV-3) infection and association with disease in swine

Abstract

El circovirus porcí 3 (PCV-3) s’ha identificat en porcs afectats per diversos problemes clínics, així com en animals sans. No obstant, la mera detecció de virus no implica causalitat en la malaltia. A més, molts dels estudis publicats no inclouen un grup d’animals sans com a control, dificultant així la interpretació de la possible implicació del virus en el desenvolupament de la malaltia. L’ objectiu d’aquesta Tesi va ser estudiar el potencial de PCV-3 com a causa de malaltia a través de quatre estudis.

En el primer estudi es va avaluar la possible associació de PCV-3 amb malalties respiratòries o entèriques. Es van analitzar sèrums de porcs post-deslletament que patien trastorns respiratoris (n=129) o digestius (n=126) i d’animals sans (n=60). Les mostres es van analitzar mitjançant PCR i els positius mitjançant una qPCR. Part de les mostres positives, es van seqüenciar i analitzar filogenèticament. PCV-3 es va detectar en un 6% tant en animals amb trastorns respiratoris (8/129) com digestius (7/126) i en un 7% (4/60) en els animals sans. grups Aquest resultats indiquen que PCV-3 no és una possible causa de trastorns respiratoris o digestius.

En segon lloc, es va estudiar la freqüència de PCV-3 a sèrums de truges primípares (n=57) i multípares (n=64) en dos moments de la gestació, i en teixits (cervell i pulmó) dels seus respectius fetus nascuts morts o momificats (n=255) procedents de tres granges sense problemes reproductius. Les mostres es van analitzar mitjançant PCR i els positius mitjançant una qPCR. Part de les mostres positives es van seqüenciar i analitzar filogenèticament. Mentre que tots els sèrums de truges multípares van ser negatius, un 33% (19/57) dels sèrums de truges primípares van ser positius. Els fetus van mostrar un 33% (86/255) de positivitat. La freqüència en fetus de truges primípares (73/91, 80%) va ser significativament més gran que la de multípares (13/164, 8%). Aquests resultats indiquen que PCV-3 pot causar infeccions intrauterines en absència de trastorns reproductius evidents.

En un tercer estudi, s’avaluà la freqüència de detecció en casos de problemes reproductius evidents i la possible associació amb lesions observades en fetus avortats. Es van analitzar 53 casos reproductius (mescla de teixits) mitjançant qPCR. Les mostres amb alta càrrega de PCV-3 es van analitzar mitjançant hibridació in situ (ISH) i es van seqüenciar i analitzar filogenèticament. PCV-3 es va detectar en 18/53 (34%) casos mitjançant qPCR i en 4 dels 6 analitzats per ISH. També es van buscar altres virus causants de malalties reproductives (virus de la síndrome respiratòria i reproductiva porcina [PRRSV], parvovirus porcí 1 [PPV1] i circovirus porcí 2 [PCV-2]). PRRSV i PCV-2 es van detectar en 4 i 5 casos, respectivament. L’elevada càrrega vírica de PCV-3 i l’associació amb les lesions observades suggereixen a aquest virus com a un potencial causant de problemes reproductius.

L’anàlisi filogenètic realitzat en aquets tres estudis va classificar les seqüencies obtingudes del genoma sencer o de l’ORF2 com a PCV-3a.

Per últim es van analitzar mitjançant una ISH mostres de quatre porcs post-deslletament clínicament afectats per aprimament (negatius a PCV-2 i PRRSV) i amb inflamació multisistèmica. També es van incloure dos animals de la mateixa granja no afectats. PCV-3 es va detectar en les lesions histològiques en múltiples teixits dels quatre animals malalts, però no en els dos animals sans. Aquests resultats, apunten que PCV-3 pugui causar malaltia en porcs post-deslletament.

En conclusió, en aquesta Tesi s’han generat coneixements rellevants sobre dades clíniques, patològiques i virològiques de la infecció per PCV-3. Aquestes dades suggereixen que el PCV-3 pot causar malaltia en porcs i ressalten la necessitat d’establir criteris de diagnòstic per als trastorns reproductius i pre-/post-deslletament.

El circovirus porcino 3 (PCV-3) se ha identificado en cerdos afectados por diversas condiciones clínico-patológicas, así como en animales sanos. Sin embargo, la mera detección del virus no implica causalidad en la enfermedad. Además, muchos de los estudios publicados no incluyen un grupo de animales sanos como control, dificultando la interpretación de la posible implicación del virus en la enfermedad. Esta Tesis tuvo como objetivo estudiar el potencial de PCV-3 como causa de enfermedad. Para ello, se realizaron cuatro estudios.

En el primer estudio se evaluó la posible asociación de PCV-3 con desórdenes respiratorios o entéricos. Se analizaron sueros de cerdos post-destete que presentaban trastornos respiratorios (n=129) o digestivos (n=126) así como de animales sanos (n=60). Las muestras se analizaron mediante PCR y, en los positivos, mediante una qPCR. Parte de las muestras positivas, se secuenciaron y analizaron filogenéticamente. PCV-3 se detectó en un 6% tanto en animales con trastornos respiratorios (8/129) como digestivos (7/126), y en un 7% (4/60) en los animales sanos. La similitud en los porcentajes de detección indicó que PCV-3 no parece una posible causa de enfermedad respiratoria o digestiva.

En segundo lugar, se estudió la frecuencia de PCV-3 en sueros de cerdas primíparas (n=57) y multíparas (n=64) en dos momentos de la gestación, y en tejidos (cerebro y pulmón) de sus respectivos fetos mortinatos o momificados (n=255) procedentes de tres granjas sin problemas reproductivos. Las muestras se analizaron mediante PCR y, en los positivos, mediante una qPCR. Parte de las muestras positivas se secuenciaron y analizaron filogenéticamente. Mientras que todos los sueros de cerdas multíparas fueron negativos, un 33% (19/57) de sueros de cerdas primíparas fueron positivos. Los fetos mostraron un 33% (86/255) de positividad. La frecuencia de detección en fetos de cerdas primíparas (73/91, 80%) fue significativamente mayor que la de multíparas (13/164, 8%). Este estudio demostró que PCV-3 puede causar infecciones intrauterinas en ausencia de trastornos reproductivos evidentes.

En un tercer estudio, se evaluó la frecuencia de detección de PCV-3 en casos de problemas reproductivos evidentes y la posible asociación con lesiones observadas en fetos abortados. Se analizaron 53 casos reproductivos (mezcla de tejidos) mediante qPCR. Las muestras con alta carga vírica se analizaron mediante hibridación in situ (ISH) y se secuenciaron y analizaron filogenéticamente. PCV-3 se detectó en 18/53 (34%) casos mediante qPCR y en 4 de los 6 analizados por ISH. También se investigaron otros virus causantes de enfermedades reproductivas (virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino [PRRSV], parvovirus porcino 1 [PPV1] y circovirus porcino 2 [PCV-2]). PRRSV y PCV-2 se detectaron en 4 y 5 casos, respectivamente. Los casos con mayor carga vírica de PCV-3 y su asociación con las lesiones sugieren al virus como potencial causante potencial de problemas reproductivos

Los análisis filogenéticos realizados en estos tres primeros estudios clasificaron a las secuencias del genoma entero y del ORF-2 obtenidas como PCV3a, mostrando una elevada identidad nucleotídica.

Por último, se testaron muestras de tejidos de cuatro cerdos post-destete, clínicamente afectados por desmedro (negativos a PCV-2 y PRRSV) y con inflamación multisistémica, mediante una ISH especifica de PCV-3. Además, también se incluyeron dos animales de la misma granja no afectados clínicamente. El virus se detectó en histológicas observadas en múltiples tejidos de los cuatro animales enfermos, pero no en los dos animales sanos. Estos resultados, apuntan que PCV-3 pueda causar enfermedad en cerdos post-destete.

En conclusión, en esta Tesis se han generado conocimientos relevantes sobre datos clínicos, patológicos y virológicos de la infección por PCV-3. Estos datos sugieren que el virus puede causar enfermedad en cerdos y resaltan la necesidad de establecer criterios diagnósticos para los trastornos reproductivos y pre-/post-destete.

Porcine circovirus 3 (PCV-3) has been identified in pigs suffering from different disease conditions, as well as in healthy animals. However, the mere detection of the virus does not imply disease causality. Moreover, in most studies, a healthy control group was not included, complicating the interpretation of the potential implication of the virus in the disease development. Thus, this Thesis was aimed to study the potential of PCV-3 as a cause of disease in pigs. To reach this main goal, four studies were conducted.

The first study assessed the potential association of PCV-3 with respiratory or enteric diseases in pigs. Sera of postweaning pigs displaying respiratory (n=129) or digestive (n=126) disorders and of healthy ones (n=60) were analyzed by PCR and, when positive, by a real time quantitative PCR (qPCR). Moreover, selected samples were sequenced and phylogenetically analyzed. PCV‐3 was found in 6% in animals showing respiratory (8/129) and digestive (7/126) disorders, and in 7% (4/60) of healthy pigs. The similar percentages of infection among groups indicated that PCV-3 is not a potential cause of respiratory or digestive disorders.

Secondly, the frequency of PCV-3 infection was studied in sera of primiparous (n=57) and multiparous (n=64) sows at two time points, and in tissues (brain and lung) from their respective stillborn or mummified fetuses (n=255) from three farms without reproductive problems. Samples were tested by PCR and, when positive, by a qPCR; selected samples were sequenced and phylogenetically analyzed. All sera from multiparous sows were negative, while 19/57 (33%) sera from primiparous sows were positive. Fetuses showed 33% (86/255) of PCR positivity; however, the frequency of viral detection in fetuses from primiparous sows (73/91, 80%) was significantly higher than that from multiparous ones (13/164, 8%). This study demonstrated that PCV-3 can cause intrauterine infections in absence of overt reproductive disorders.

In a third study, the frequency of PCV-3 in cases of overt reproductive problems and the possible association with the lesions observed in aborted fetuses were evaluated. Thus, 53 reproductive cases (tissue pools) were analyzed by qPCR. Samples with high PCV-3 load were further tested by in situ hybridization (ISH), sequenced and phylogenetically analyzed. PCV-3 DNA was detected in 18/53 (34%) cases by qPCR and in 4 out of the 6 tested by ISH. Other viruses able to cause reproductive diseases (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus [PRRSV], Porcine parvovirus 1 [PPV1] and Porcine circovirus 2 [PCV-2]) were also investigated. PRRSV and PCV-2 were found in 4 and 5 cases, respectively. The higher PCV-3 loads detected in some cases of reproductive disorders and their association with lesions point out this virus as a potential agent able to cause reproductive failure.

In the phylogenetical analyses performed in these three studies, all whole genome and ORF-2 PCV-3 sequences obtained were classified as PCV-3a, being closely related with regards nucleotide identity.

In the fourth study, samples of four post-weaning pigs displaying wasting (negative to PCV-2 and PRRSV), and a multisystemic inflammatory condition, were analyzed by a PCV-3 ISH. Two non-affected animals from the same farm were also tested. PCV-3 was found within histologic lesions in multiple tissues of the four diseased animals, while it was not found in the two non-affected animals. The present case report further suggests PCV-3 as a potential infectious agent able to cause disease in post-weaning pigs.

In conclusion, this Thesis generated relevant knowledge on clinical, pathological and virological data of PCV-3 infection. These data further support the potential pathogenicity of this virus and, thus, highlighting the need to establish diagnostic criteria for the reproductive and pre-/post-weaning disorders of swine.