Entomopathogenic nematodes and Drosophila suzukii: from biological control to immunology perspective

Abstract

Drosophila suzukii es una plaga invasora que ataca a fruits vermells, maduixes i cireres ja que les larves se’n alimenten abans de la maduració del fruit. En aquesta tesis s’avalua la potencialitat dels nematodes entomopatògens com agents de control biològic per controlar D. suzukii, al mateix temps que es determina el paper del sistema immunològic de l’insecte en front la infecció. En els dos primers capítols, s’analitza la susceptibilitat de les diferents etapes de desenvolupament de la mosca enfront dels nematodes Steinernema feltiae, Steinernema carpocapsae i Heterorhabditis bacteriophora en condicions de laboratori. Les larves són altament susceptibles a totes les espècies de nematodes emprades, en canvi no es va registrar cap infecció durant l’etapa de pupa. En la fase adulta només S. carpocapsae va ser capaç d’infectar aconseguint un percentatge d’infecció molt elevada en adults que acabaven d’emergir en comparació als adults madurs. A més també s’han dut a terme dues proves preliminars d’aplicació de nematodes sobre fruit i a terra en condicions de laboratori. Per tal de combinar l’aplicació de nematodes amb altres agents de control biològic com són insectes depredadors o parasitoids, en el tercer capítol s’han realitzat assajos de compatibilitat en placa de Petri i en planta. Aquests experiments han demostrat que els nematodes no han infectat els insectes beneficiosos en condicions de planta i podrien ser utilitzats conjuntament. El desenvolupament de la resposta immune en el procés infectiu de S. carpocapsae i el bacteri simbiont X. nematophila és desconegut en D. suzukii i per tant s’han enfocat dos capítols per l’estudi a nivell efectiu i regulador. Mitjançant assajos fisiològics i d’expressió gènica s’han avaluat 6 vies immunològiques incloent processos humorals, cel·lulars i d’activació global. Pel que fa la resposta humoral, no s’ha detectat una activació en presència del nematode i només s’han activat els gens de Toll i Imd quan s’ha alliberat el bacteri. A nivell efector va significar un augment de pèptids antimicrobians en l’hemolimfa, tot i que la seva activitat va ser bloquejada per l’acció del bacteri. A nivell cel·lular, el nematode tampoc va ser reconegut pels receptors corresponents i no es van activar ni la via Jak/STAT ni proPO. Per tant els hemòcits no es van activar i no es va detectar ni encapsulació del nematode ni fagocitosi del bacteri. A més sense l’activació de les cèl·lules cristal·lines tampoc s’allibera l’enzim fenol-oxidasa i no es pot desenvolupar la resposta de melanització. Igualment s’ha descrit com en presència de X. nematophila, l’enzim presenta una baixada d’activitat en l’hemolimfa. Finalment, JNK i TGF-β són vies relacionades amb l’activació global en condicions d’estrès que no s’han vist alterades per la infecció nematode-bacteriana. Aquests resultats mostren els mecanismes emprats pel complex S. carpocapsae - X. nematophila per superar les defenses de l’insecte. Aquesta tesis engloba la relació entre nematodes entomopatògens i D. suzukii establint les bases de susceptibilitat amb les quals desenvolupar una estratègia de control biològic, i el coneixement del procés infectiu entre hoste i patogen.

Drososphila suzukii es una plaga invasora que ataca a frutos rojos, fresas y cerezas ya que las larvas se alimentan antes de la maduración del fruto. En esta tesis se evalúa la potencialidad de los nematodos entomopatógenos como agentes de control biológico para controlar D. suzukii, a la vez que se determina el papel del sistema inmunológico del insecto frente a la infección. En los dos primeros capítulos, se analiza la susceptibilidad de las etapas de desarrollo de la mosca frente a los nematodos Steinernema feltiae, Steinernema carpocapsae y Heterorhabditis bacteriophora en condiciones de laboratorio. Las larvas son altamente susceptibles a todas las especies de nematodo usadas, en cambio no se registró ninguna infección durante la etapa de pupa. En la fase adulta solo S. carpocapsae fue capaz de infectar, consiguiendo un porcentaje de infección elevado en adultos que acaban de emerger en comparación con adultos maduros. Además, también se realizaron dos pruebas preliminares de aplicación de nematodos en fruto y tierra en condiciones de laboratorio. Para combinar la aplicación de nematodos con otros agentes de control biológico como son insectos depredadores y parasitoides, en el tercer capítulo se han realizado ensayos de compatibilidad en placa de Petri y en planta. Estos experimentos han demostrado que los nematodos no han infectado los insectos beneficiosos en condiciones de planta y podrían ser usados conjuntamente. El desarrollo de la respuesta inmune en el proceso infectivo de S. carpocapsae y la bacteria simbionte X. nematophila es desconocido en D. suzukii y por lo tanto se ha abordado en dos capítulos el estudio a nivel efectivo y regulador. Mediante ensayos fisiológicos y de expresión génica se han evaluado 6 vías inmunológicas incluyendo procesos humorales, celulares i de activación global. En la respuesta humoral no se detectó una activación en presencia del nematodo y solo se activaron los genes Toll y Imd cuando fue liberada la bacteria. A nivel efector eso significó un aumento de péptidos antimicrobianos en hemolinfa, a pesar de que su actividad fue bloqueada por la acción de la bacteria. A nivel celular, el nematodo tampoco fue reconocido por los receptores correspondientes i no se activó ni la vía Jak/STAT ni proPO. Por lo tanto, los hemocitos no se activaron y no se encapsularon los nematodos ni fagocitó la bacteria. Además, sin la activación de las células cristalinas tampoco se liberó la enzima fenol-oxidasa y no se pudo desarrollar la respuesta de melanización. Igualmente se ha descrito como en presencia de X. nematophila, la enzima presenta una bajada de actividad en hemolinfa. Finalmente, JNK y TGF-β son vías relacionadas con la activación global en condiciones de estrés que no se han alterado por la infección. Estos resultados muestran los mecanismos usados por el complejo S. carpocapsae – X. nematophila para superar las defensas del insecto. Esta tesis engloba la relación entre nematodos entomopatógenos y D. suzukii estableciendo las bases de susceptibilidad con las cuales desarrollar una estrategia de control biológico, y el conocimiento del proceso infectivo entre huésped y patógeno.

Drosophila suzukii is an invasive pest that attacks berries, strawberries, and cherries because larvae feed from ripen fruit causing great losses. In this thesis, the potentiality of entomopathogenic nematodes as biological control agents was evaluated to control D. suzukii, as well as to determine the role of insect’s immune system against infection. In the two first chapters, we studied the susceptibility of the developmental stages of the fly against the nematodes Steinernema feltiae, Steinernema carpocapsae and Heterorhabditis bacteriophora under laboratory conditions. Larvae were highly susceptible to all tested nematodes, although no infection was detected during pupal stage. In the adult stage, only S. carpocapsae managed to infect the fly with a high percentage of infection in teneral adults (newly emerged) compared to mature adults. Moreover, two preliminary tests of nematode application were carried out in fruit and soil under laboratory conditions with promising results. In order to perform combined application of nematodes and other biological control agents such as insect predators and parasitoids, in the third chapter, compatibility experiments were done in Petri dish and plant pot. These assays showed no infection of nematodes to the beneficial insects under plant pot conditions. Thus, these agents could be used together. The development of the immune response to the infective process of S. carpocapsae and the symbiont bacteria X. nematophila was unknown in D. suzukii. For this reason, two chapters were focused on the immune study at effective and regulatory level. Through physiological and gene expression assays, 6 immune pathways were studied including humoral and cellular processes, and global activation. Regarding the humoral response, there was no activation under nematode presence and the upregulation of Toll and Imd genes happened only after bacterial release. At the effector level these resulted in an increase of antimicrobial peptides in haemolymph, although the activity was supressed by the bacteria. At cellular level, nematodes were not recognised by the receptors and Jak/STAT and proPO were not activated in response. In consequence, haemocytes were unactive and neither encapsulation of nematodes nor phagocytosis of bacteria was detected. Moreover, without the activation of crystal cells, there was no release of phenol-oxidase enzyme and the fly was unable to develop the melanization response. With the presence of X. nematophila, the enzyme presented a reduced activity in haemolymph too. Finally, JNK and TGF-β are pathways related to global activation under stress conditions, but these presented no variations under nematode-bacterial infection. These results showed the mechanisms used by the complex S. carpocapsae – X. nematophila to overcome the insect defences. This thesis encompasses the relation between entomopathogenic nematodes and D. suzukii establishing the susceptibility baseline to develop a biological control strategy and the knowledge of the infective process between host and pathogen.