Desarrollo de métodos rápidos para la detección de bacteriófagos como indicadores de contaminación fecal

Abstract

El control de la transmisión de patógenos víricos a través de la ruta fecal-oral ha adquirido recientemente relevancia e interés público. Para mantener este control, es necesario determinar indicadores apropiados para la predicción de comportamiento y transmisión de los virus en las matrices ambientales. Los bacteriófagos han sido propuestos como indicadores víricos de contaminación fecal desde hace varias décadas y están siendo incorporados gradualmente como organismos indicadores en numerosas normativas de gestión del agua, como las nuevas directivas de la Unión Europea para el control de calidad de aguas de consumo y aguas regeneradas. Como consecuencia, será necesario disponer de métodos que permitan detectar bacteriófagos de manera sencilla, rápida, robusta y eficiente. Esta necesidad ha impulsado la mejora y el desarrollo de nuevos métodos de detección, ya que los métodos tradicionales requieren más de un día de trabajo para proporcionar resultados y pueden ser difíciles de implementar en laboratorios de análisis rutinario. Bajo este contexto se ha desarrollado el método Bluephage, un método colorimétrico que permite la detección cualitativa de los diferentes grupos de colifagos mediante la liberación de la enzima β-glucuronidasa al exterior celular por la lisis bacteriana. Este método es posible gracias a una serie de modificaciones genéticas realizadas en las cepas huéspedes empleadas para la detección de colifagos, bloqueando el transporte de los sustratos de la enzima al interior celular y sobreexpresando la enzima intracelularmente. Sólo después de la lisis mediada por fagos, la enzima sobreexpresada puede salir de la célula, encontrar el sustrato en el medio, degradarlo y producir un cambio colorimétrico del medio de amarillo a azul. Este método supone una mejora respecto a los métodos tradicionales, ya que permite la detección en menos de 6 horas de hasta 1 colifago en volúmenes de muestra de hasta 100 ml. Presenta una sensibilidad, especificidad y precisión equivalentes a los métodos estandarizados y es adaptable a volúmenes de muestra grandes y pequeños, a muestras de diferentes orígenes, a la detección de todos los grupos de colifagos y a resultados cuantitativos mediante la aplicación de la técnica del Número Más Probable sobre los resultados cualitativos. En definitiva, Bluephage es el método microbiológico más rápido descrito hasta la fecha para la detección de contaminación fecal utilizando microorganismos cultivables y puede proveer resultados cuando la información rápida de contaminación fecal es esencial.

Relevance and public interest in controlling fecal transmission of viral pathogens has been recently increasing worldwide. Consequently, this has created a need for establishing suitable indicators for predicting viral behavior and transmission in the environment. Bacteriophages have been proposed as viral fecal indicators for decades and they are currently being incorporated into multiple guidelines and regulations of water management, such as the new European Union directives for maintaining water quality of drinking water and reclaimed water. Thus, the development and improvement of methods that allow a fast, user-friendly, robust, and efficient bacteriophage detection is required, as traditional methods entail more than a day of work to provide results and their implementation can be cumbersome for routine analysis laboratories. Under these global circumstances, Bluephage has been developed as a possible solution for these difficulties. Bluephage is a colorimetric methodology qualitatively capable of detecting all groups of coliphages thanks to the release into the external medium of the enzyme β- glucuronidase during lytic processes. This is attainable thanks to the genetic modifications performed on the host bacteria used to detect these coliphages, which blocks the import of the substrate into the cells and overexpresses this intracellular enzyme. Only after phage-mediated lysis, the overexpressed enzyme can be released from the cells, encounter the substrate in the medium, cleave it and produce a colorimetric change of the medium from yellow to blue. This method is an improvement over traditional methods, allowing the detection of up to 1 coliphage in samples up to 100 ml in less than 6 hours. Its sensitivity, specificity and precision are equivalent to standardized methods and it can be scaled to different sample volumes, adapted for analysis of samples from different origins and detection of different types of coliphages. It is also possible to achieve quantitative results from the qualitative data using the Most Probable Number approach. Overall, Bluephage is the fastest microbiological culture- based method for detecting viral fecal pollution described to date and can provide results where rapid information about fecal pollution is essential.