MAP quinasa ERK5: una nueva diana antitumoral en cáncer endometrioide y neuroblastoma

Abstract

La via de senyalització de la MAP quinasa ERK5 s'activa en resposta a factors de creixement i diferents formes d'estrès. Durant els últims anys, diversos treballs han mostrat que ERK5 juga un paper important en la proliferació i supervivència en diferents paradigmes del càncer. No obstant això, aquestes evidències experimentals s'han aconseguit utilitzant inhibidors d'ERK5 que posteriorment han demostrat no ser específics. Entre altres, aquests inhibidors d'ERK5 també afecten l'activitat del regulador transcripcional BRD4 (una coneguda diana antitumoral), per la qual cosa recentment s'ha posat en qüestió el paper d'ERK5 com a regulador de la proliferació i de la supervivència tumoral.

En aquest treball hem caracteritzat JWG-071, un inhibidor competitiu i específic d'ERK5 (ERK5i) sense activitat BRD4. Aquest petit compost mostra uns excel·lents paràmetres farmacocinètics, i inhibeix ERK5 eficientment en línies cel·lulars i en tumors xenografts. Per al desenvolupament preclínic d'aquest inhibidor d'ERK5 de nova generació s'han utilitzat models de càncer ginecològic endometrioide i cervical, no estudiats fins avui.

Els nostres resultats mostren que ERK5 regula la proliferació de línies cel·lulars de càncer ginecològic, a través del factor de transcripció AP-1. Així, la inhibició farmacològica (JWG-071) o genètica (cèl·lules CRISPR/Cas9 MEK5-/-) d'ERK5 redueix la proliferació cel·lular i el creixement de tumors xenografts de càncer endometrioide (cèl·lules Ishikawa). D'altra banda, presentem evidències que mostren que l'activitat quinasa d'ERK5 és necessària per a la supervivència de línies cel·lulars de càncer endometrioide i cervical. Així, la inhibició d'ERK5 indueix apoptosi en aquestes línies i en tumors xenografts de cèl·lules Ishikawa, a través de la inhibició de la via canònica de NF-kB, una via que regula la proliferació i supervivència del càncer endometrioide. Mecanísticament, la inhibició d'ERK5 resulta en una dràstica reducció del regulador apical NEMO/IKKg, cosa que porta a la inhibició de l'expressió, localització nuclear i activitat transcripcional de p65/RELA. Així mateix, vam mostrar que la inhibició de NF-kB en resposta al JWG-071 resulta en l'activació de la via apoptótica regulada per JNK, tant in vitro (línies cel·lulars) com in vivo (tumors xenografts). D'acord amb aquests resultats, que mostren una relació funcional entre ERK5 i NF-kB, mostres de pacients amb càncer endometrioide presenten una elevada expressió proteica d'ERK5 i p65/RELA, comparada amb el teixit peritumoral. Finalment, la inhibició d'ERK5 sensibilitza cèl·lules de càncer endometrioide i cervical a la quimioteràpia estàndard. D'interès, l'administració sistèmica de JWG-071 sensibilitza a tumors xenogratfs endometrioides (Ishikawa) al tractament amb paclitaxel. En definitiva, proposem ERK5 com una nova diana per al tractament del càncer endometrioide.

D'altra banda, en aquest treball s'han obtingut evidències preliminars que mostren que ERK5 nuclear juga un rol important en la supervivència i resistència a la quimioteràpia del neuroblastoma (NBL) humà. Utilitzant un panell de línies cel·lulars NBL, vam mostrar que cèl·lules NBL quimiosensibles (p53 funcional) presenten ERK5 citosólica i són sensibles als ERK5i. Per contra, cèl·lules NBL d'alt risc quimiorresistents (p53 no-funcional) presenten ERK5 nuclear i escassa sensibilitat als ERK5i. D'interès, la sobreexpressió d'una forma constitutivament nuclear d'ERK5 confereix resistència al cisplatí en cèl·lules NBL quimiosensibles, mitjançant la reducció de l'expressió i activitat transcripcional de p53. Finalment, s'ha dut a terme un estudi amb la finalitat de valorar l'impacte del silenciament d'ERK5 en el transcriptoma de dues línies cel·lulars de NBL quimiorresistents. Els resultats preliminars mostren que l'absència d'ERK5 indueix canvis en l'expressió de gens relacionats amb el cicle cel·lular, transcripció i apoptosi, la qual cosa ens porta a proposar al NBL quimiorresistent com a model per a validar l'acció antitumoral de fàrmacs degraders (PROTACs) d'ERK5.

La vía de señalización de la MAP quinasa ERK5 se activa en respuesta a factores de crecimiento y diferentes formas de estrés. Durante los últimos años, varios trabajos han mostrado que ERK5 juega un papel importante en la proliferación y supervivencia en diferentes paradigmas del cáncer. Sin embargo, estas evidencias experimentales se han conseguido utilizando inhibidores de ERK5 que posteriormente han demostrado no ser específicos. Entre otros, estos inhibidores de ERK5 también afectan a la actividad del regulador transcripcional BRD4 (una conocida diana antitumoral), por lo que recientemente se ha puesto en cuestión el papel de ERK5 como regulador de la proliferación y de la supervivencia tumoral.

En este trabajo hemos caracterizado JWG-071, un inhibidor competitivo y específico de ERK5, sin actividad BRD4. Este pequeño compuesto muestra unos excelentes parámetros farmacocinéticos, e inhibe ERK5 eficientemente en líneas celulares y en tumores xenografts. Para el desarrollo preclínico de este inhibidor de ERK5 de nueva generación se han utilizado modelos de cáncer ginecológico endometrioide y cervical, no estudiados hasta la fecha.

Nuestros resultados muestran que ERK5 regula la proliferación de líneas celulares de cáncer ginecológico, a través del factor de transcripción AP-1. Así, la inhibición farmacológica (JWG-071) o genética (células CRISPR/Cas9 MEK5-/-) de ERK5 reduce la proliferación celular y el crecimiento de tumores xenografts de cáncer endometrioide (células Ishikawa). Por otra parte, presentamos evidencias que muestran que la actividad quinasa de ERK5 es necesaria para la supervivencia de líneas celulares de cáncer endometrioide y cervical. Así, la inhibición de ERK5 induce apoptosis en estas líneas y en tumores xenografts de células Ishikawa, al inhibir la vía canónica de NF-kB, una vía que regula la proliferación y supervivencia del cáncer endometrioide. Mecanísticamente, la inhibición de ERK5 resulta en una drástica reducción del regulador apical NEMO/IKKg, lo que conduce a la inhibición de la expresión, localización nuclear y actividad transcripcional de p65/RELA. Asimismo, mostramos que la inhibición de NF-kB en respuesta al JWG-071 resulta en la activación de la vía apoptótica regulada por JNK, tanto in vitro (líneas celulares) como in vivo (tumores xenografts). De acuerdo con estos resultados, que muestran una relación funcional entre ERK5 y NF-kB, muestras de pacientes con cáncer endometrioide presentan una elevada expresión proteica de ERK5 and p65/RELA, comparada con el tejido peritumoral. Finalmente, la inhibición de ERK5 sensibiliza células de cáncer endometrioide y cervical a la quimioterapia estándar. De interés, la administración sistémica de JWG-071 sensibiliza a tumores xenogratfs endometrioides (Ishikawa) al tratamiento con paclitaxel. En definitiva, proponemos ERK5 como una nueva diana para el tratamiento del cáncer endometrioide.

Por otra parte, en este trabajo se han obtenido evidencias preliminares que muestran que ERK5 nuclear media en la supervivencia y resistencia a la quimioterapia del neuroblastoma (NBL) humano. Utilizando un panel de líneas celulares NBL, mostramos que células NBL quimiosensibles (p53 funcional) presentan ERK5 citosólica y son sensibles a los ERK5i. Por el contrario, células NBL de alto riesgo quimorresistentes (p53 no-funcional) presentan ERK5 nuclear y escasa sensibilidad a los ERK5i. De interés, la sobreexpresión de una forma constitutivamente nuclear de ERK5 confiere resistencia al cisplatino en células NBL quimiosensibles, al reducir la expresión y actividad transcripcional de p53. Finalmente, se ha llevado a cabo un estudio con el fin de valorar el impacto del silenciamiento de ERK5 en el transcriptoma de dos líneas celulares de NBL quimiorresistentes. Los resultados preliminares muestran que la ausencia de ERK5 induce cambios en la expresión de genes relacionados con el ciclo celular, transcripción y apoptosis, lo que nos lleva a proponer al NBL quimiorresistente como modelo para validar la acción antitumoral de fármacos degraders (PROTACs) de ERK5.

The MAP kinase ERK5 signaling pathway is activated in response to growth factors and different forms of stress. During the last few years, several works have shown that ERK5 plays an important role in regulating cell proliferation and survival in different cancer paradigms. However, these experimental evidences were achieved using ERK5 inhibitors that, subsequently, were shown to be non-specific. Among others, first generation ERK5 inhibitors also impair the activity of the transcriptional regulator BRD4 (a known antitumor target). Consequently, the role of ERK5 as a regulator of tumor proliferation and survival has recently been questioned.

Here, we have characterized JWG-071, a new generation competitive and specific ERK5 inhibitor, without BRD4 activity. This small compound exhibits excellent pharmacokinetic parameters, and inhibits ERK5 efficiently in cell lines and in xenograft tumors (systemic administration). To perform the preclinical development of JWG-071, we have used endometrioid and cervical gynecological cancer models. The role of ERK5 in these cancer models has not been previously reported.

We show that ERK5 regulates proliferation of gynecological cancer cell lines, through activation of the transcription factor AP-1. Thus, pharmacological (JWG-071) or genetic (CRISPR/Cas9 MEK5-/- cells) inhibition of ERK5 impairs proliferation and growth of endometrioid cancer cells and xenografts (Ishikawa cells). Moreover, in this work we present evidences supporting that ERK5 kinase activity is required for the survival of endometrioid and cervical cancer cell lines. Thus, ERK5 inhibition induces apoptosis in cell lines and in xenografts tumors (Ishikawa cells), by impairing the canonical NF-kB pathway. The NF-kB pathway regulates endometrioid cancer proliferation and survival. Mechanistically, ERK5 inhibition results in a drastic reduction of the upstream regulator NEMO/IKKg, leading to inhibition of p65/RELA expression, nuclear localization and transcriptional activity. Furthermore, we show that inhibition of NF-kB in response to JWG-071 results in activation of the JNK-regulated apoptotic pathway, both in vitro (cell lines) and in vivo (tumor xenografts). In agreement with this, human endometrioid tumors show elevated levels of ERK5 and RELA proteins, compared to peritumoral tissue. Finally, we show that ERK5 inhibition sensitizes endometrioid and cervical cancer cells to standard chemotherapy. Of interest, systemic administration of JWG-071 sensitizes endometrioid xenografts tumors (Ishikawa cells) to paclitaxel treatment. Overall, we propose ERK5 as a new target to tackle endometrioid cancer.

We also provide preliminary evidences showing that nuclear ERK5 plays a role in modulating neuroblastoma cancer survival and resistance to chemotherapy. Using a panel of NBL cell lines, we found that chemosensitive (functional p53) NBL cells are sensitive to ERK5 inhibitors, and show a cytosolic ERK5 localization. On the contrary, high-risk chemoresistant (non-functional p53) NBL cells are less sensitive to ERK5 inhibitors and show nuclear ERK5 localization. Interestingly, chemosensitive NBL IMR-32 and SH-SY5Y cells became resistant to cisplatin in response to overexpression of a constitutively nuclear form of ERK5, by a mechanism that impairs p53 expression and transcriptional activity. Finally, we performed a transcriptome (DNA microarrays) analysis to investigate the impact of ERK5 silencing (shRNAi) in high-risk chemoresistant NBL CHLA-90 and SK-N-BE(2) cell lines. Preliminary analysis show that depletion of the ERK5 protein induces changes in the expression of genes related to cell cycle, transcription and apoptosis. These results leads us to propose chemoresistant NBL as a model to validate the antitumor action of ERK5 degrader drugs (PROTACs).