Tinkering with carbohydrate-active enzymes for novel specificities: Chitin deacetylases and Glycosidases

Abstract

Aquesta tesi és divideix en dos temes en funció dels enzims estudiats: quitina desacetilases i glicosidases. En ambdós casos, l'objectiu és modificar l'especificitat per substrat per dissenyar nous biocatalitzadors. Les quitina desacetilases actuen sobre la quitina per obtenir el quitosà. Els quitosans són una família de polisacàrids compostos de N-acetil-glucosamina i glucosamina. Els oligosacàrids de quitosà han demostrat ser molècules bioactives amb una gran varietat d'aplicacions en els camps de la biotecnologia i la biomedicina. Amb l’objectiu de superar els problemes de la desacetilació química de la quitina per l’obtenció del quitosà és va utilitzar l'alta selectivitat en termes de preferència per substrat i rendiments de producte de les reaccions enzimàtiques. La resolució de l'estructura 3D de la quitina desacetilasa de Vibrio cholera en complex amb diferents substrats va ser una fita clau en l'establiment del model Subsite Capping Model per racionalitzar els patrons de desacetilació específics d’aquesta família d’enzims. L'objectiu principal del primer tema de la tesi consisteix en l'avaluació de les relacions estructura-funció amb l'objectiu de donar suport a la hipòtesi del Subsite Capping Model i modificar l'especificitat per substrat de la quitina deacetilasa de Vibrio cholera cap a nous biocatalitzadors. Després de dissenyar un assaig de cribratge d'alt rendiment que permet determinar l'activitat desacetilasa en quitooligosacàrids, és van preparar una sèrie de mutants que implicaven des del loop 5 als subsetis positius que envolten el centre actiu de l’enzim basats tant, en un disseny racional així com d'evolució dirigida. Els experiments estructurals i cinètics dels mutants dissenyats permeten concloure que la modificació de la dinàmica dels loops afecta no només l'especificitat del substrat, sinó també el mecanisme d'unió, canviant el mecanisme de selecció conformacional de l'enzim wild-type a un mecanisme d'ajustament induït permeten així dilucidar els determinants moleculars que defineixen l'especificitat per substrat. El segon tema de la tesi tracta sobre l’enginyeria de la família de les glucosidases per estudiar i modificar les interaccions enzim-substrat amb una potencial classe de substrats, els septanòsids, anells de set membres, no naturals que són homòlegs a l’anell de piranosa. L'objectiu és redissenyar una glucosidasa per acceptar septanòsids amb la finalitat de convertir-se en un nou sistema biortogonal amb diverses aplicacions en el camp de la biotecnologia. En la present tesi és va aconseguir la síntesi de septanòsids cromogènics com a substrats potencials per al cribatge d'un panell de glicosidases. És va identificar la beta-glucosidasa de Streptomyces sp. com a principal candidat potencial per a l'enginyeria de l'activitat hidrolasa. Els estudis preliminars de mutagènesi van identificar una sèrie de residus del centre actiu com a candidats per a la preparació de biblioteques combinatòries per dissenyar l'especificitat del enzim. Així mateix, experiments in silico van establir una premissa per a noves configuracions de septànosids per augmentar el panell de substrats disponibles per a més estratègies d'evolució dirigida.

Esta tesis se divide en dos temas en función de las enzimas estudiadas: quitina desacetilasas y glicosidasas. En ambos casos, el objetivo es modificar la especificidad por sustrato para diseñar nuevos biocatalizadores. Las quitinas desacetilasas actúan sobre la quitina para obtener el quitosano. Los quitosanos son una familia de polisacáridos compuestos de N-acetil-glucosamina y glucosamina. Los oligosacáridos de quitosano han demostrado ser moléculas bioactivas con una gran variedad de aplicaciones en los campos de la biotecnología y la biomedicina. Con el objetivo de superar los problemas de la desacetilación química de la quitina para la obtención del quitosano se utilizó la alta selectividad en términos de preferencia por sustrato y rendimientos de producto de las reacciones enzimáticas. La resolución de la estructura 3D de la quitina desacetilasa de Vibrio cholera en complejo con distintos sustratos fue un hito clave en el establecimiento del modelo Subsite Capping Model para racionalizar los patrones de desacetilación específicos de esta familia de enzimas. Con ello, el objetivo principal del primer tema de la tesis consiste en la evaluación de las relaciones estructura-función con el objetivo de apoyar la hipótesis del Subsite Capping Model y modificar la especificidad por sustrato de la quitina deacetilasa de Vibrio cholera hacia nuevos biocatalizadores. Después de diseñar un ensayo de cribado de alto rendimiento que permite determinar la actividad desacetilasa en quitooligosacáridos, se prepararon una serie de mutantes que implicaban desde el loop 5 a los subsitios positivos que rodean el centro activo de la enzima basados tanto en un diseño racional así como en la evolución dirigida. Los experimentos estructurales y cinéticos de los mutantes diseñados permitieron concluir que la modificación de la dinámica de los loops afecta no sólo a la especificidad del sustrato, sino también al mecanismo de unión, cambiando el mecanismo de selección conformacional de la enzima wt a un mecanismo de el ajuste inducido permitiendo así dilucidar los determinantes moleculares que definen la especificidad por sustrato. El segundo tema de la tesis trata sobre la ingeniería de la familia de las glucosidasas para estudiar y modificar las interacciones enzima-sustrato con una potencial clase de sustratos, los septanósidos, anillos de siete miembros, no naturales que son homólogos en el anillo de piranosa. El objetivo es rediseñar una glucosidasa para aceptar septanósidos con el fin de convertirse en un nuevo sistema biortogonal con diversas aplicaciones en el campo de la biotecnología. En la presente tesis se logró la síntesis de septanósidos cromogénicos como sustratos potenciales para el cribado de un panel de glicosidasas. Se identificó la beta-glucosidasa de Streptomyces sp. como principal candidato potencial para la ingeniería de la actividad hidrolasa. Los estudios preliminares de mutagénesis identificaron una serie de residuos del centro activo como candidatos para la preparación de bibliotecas combinatorias para diseñar la especificidad de la enzima. Asimismo, experimentos in silico establecieron una premisa para nuevas configuraciones de septánosidos para aumentar el panel de sustratos disponibles para mayores estrategias de evolución dirigida.

This thesis is divided in two distinct topics based on the enzymes studied: chitin deacetylases and glycosidases. In both cases the goal is to engineer substrate specificity to design novel biocatalysts. Chitosans are a family of polysaccharides of N-acetyl-glucosamine and glucosamine. Chitosan oligosaccharides have proven to be bioactive molecules in a broad variety of applications in the fields of biotechnology and biomedicine. One way to overcome the problems of chemical deacetylation of chitin is using the high selectivity in terms of substrate preference and product yields of the enzymatic procedures. The solution of the 3D structure of the Vibrio cholera Chitin deacetylase in complex with different substrates was a milestone in the establishment of the Subsite Capping Model to rationalize CDAs specific deacetylation patterns. The main objective of the first thesis topic comprises the evaluation of structure-function relationships aiming to support the Subsite Capping Model hypothesis and modify the substrate specificity of the Vibrio cholera Chitin deacetylase towards novel biocatalysts. After designing a high throughput screening (HTS) assay for deacetylase activity on chitooligosaccharides, we prepared a series of mutants involving loop 5 at the positive subsites of the binding cleft based on rational design and directed evolution approaches. Structural and kinetic experiments of designed mutants concluded that modifying the dynamics of enzyme loops affects not only the substrate specificity towards new specificities, but also the binding mechanism, switching the conformational selection mechanism of the wt enzyme to an induced fit mechanism in a triple Proline to Glycine mutant that allowed us to elucidate the molecular determinants that define substate specificity. The second thesis topic on glycosidase engineering was a test bed to investigate and influence enzyme·ligand interactions with a different class of potential substrates, seven-member ring septanosides, unnatural druggable glycomimetics that are pyranose homologues. The aim is to engineer a Streptomyces sp. beta-glucosidase to accept septanoside substrates that may become a novel biorthogonal system with applications in chemical biology. In this work, the synthesis of chromogenic septanosides as potential glycosidase substrates was achieved for screening a panel of glycosidases. A b-glucosidase from Streptomyces was identified as a potential candidate for engineering septanoside hydrolylase activity. Preliminary mutagenesis studies identified a number of active site residues as candidates for the preparation of combinatorial libraries to engineer septanoside specificity. Likewise, docking experiments established a premise for new septanoside configurations to increase the panel of substrates available for further directed evolution strategies.