Immunopathogenesis of persistent and subclinical infections generated by Classical swine fever virus

Abstract

La pesta porcina clàssica (PPC) continua sent una de les malalties més importants en sanitat animal, inclosa a la llista de malalties de declaració obligatòria de l’Organització Mundial de Sanitat Animal (OIE). És causat pel virus de la PPC (VPPC), membre del gènere Pestivirus de la família Flaviviridae. A causa de les greus conseqüències de la PPC, en termes socioeconòmics, el control de la malaltia als països endèmics es considera una tasca de gran importància. Un dels reptes per al control de la malaltia és la presència de formes persistents de PPC al camp, que poden ser congènites o postnatals. Els animals que desenvolupen formes persistents de PPC són clínicament sans, mentre que excreten càrregues virals elevades. A més, no desenvoluparan resposta d’anticossos, cosa que els farà indetectables mitjançant els mètodes serològics per diagnòstic recomanats actualment. Addicionalment, els animals infectats persistentment seran refractaris a la vacunació. En el cas de la persistència congènita de la PPC, aquesta s’ha relacionat amb la immunotolerància, a causa de la incapacitat del fetus de reconèixer patògens després de la infecció pel VPPC. La comprensió dels mecanismes subjacents a aquestes formes de PPC serà crucial per al disseny de noves eines de diagnòstic o estratègies antivirals per aconseguir el control de la PPC. La present tesi es va centrar en l’elucidació dels mecanismes virològics i immunològics implicats en l’establiment i el manteniment de la infecció persistent congènita o postnatal pel VPPC. Amb aquesta finalitat, truges embarassades es van infectar amb soques del VPPC amb diversos graus de virulència en un moment en què s’ha establert que és possible induir una infecció congènita persistent. Es va detectar que la virulència de la soca infectant té un paper important en la transmissió transplacentària, ja que les soques de virulència alta i moderada van mostrar una transmissió més eficient per aquesta ruta que el VPPC de baixa virulència. A més, la soca de virulència moderada va ser capaç de generar persistència viral congènita en garrins. Addicionalment, es va trobar evidència de reconeixement del patogen i d’inducció de resposta immunitària innata, en termes d’interferó alfa (IFN-α) per part dels fetus i els garrins. Això contrastava amb la definició generalment reconeguda del fenomen d’immunotolerància i de la infecció congènita persistent pel VPPC. El paper de l’edat en l’establiment d’una infecció persistent postnatal pel VPPC també es va avaluar mitjançant la infecció de garrins a l’edat de deslletament amb una soca del VPPC moderadament virulenta. En alguns d’aquests animals es va generar infecció persistent postnatal. Tanmateix, es va trobar que la proporció de porcs infectats persistentment era inferior a la dels experiments anteriors en què es va dur a terme la infecció en les primeres hores després del naixement. Aquest resultat suggereix un paper molt important de l’edat en la inducció de la infecció persistent postnatal pel VPPC. En els animals infectats persistentment es van detectar marcadors d’estats immunitaris alterats. Finalment, es va determinar que les poblacions de cèl·lules precursores augmentades en animals persistentment infectats amb VPPC eren similars, en fenotip i funcionalitat, a poblacions de cèl·lules immunosupressores descobertes anteriorment en humans. Els resultats de la present tesi proporcionen informació sobre les bases virològiques i immunològiques de la persistència viral en VPPC. És possible que els porcs amb infecció postnatal persistent pel VPPC es puguin utilitzar com a model per a l’estudi de les vies d’evasió de la resposta immunitària implicades en malalties humanes i animals.

La peste porcina clásica (PPC) sigue siendo una de las enfermedades más importantes en sanidad animal, siendo incluida en la lista de enfermedades de declaración obligatoria de la Organización Mundial para la Sanidad Animal (OIE). La enfermedad es causada por el virus de la PPC (VPPC), un miembro del género Pestivirus en la familia Flaviviridae. Debido a las tremendas consecuencias de la PPC, en términos socioeconómicos, el control de la enfermedad en países endémicos es considerado como una labor de gran importancia. Uno de los desafíos para el control de la enfermedad es la presencia de formas persistentes de PPC en el campo, las cuales pueden ser congénitas o postnatales. A pesar de estar excretando altas cargas virales, los animales que padecen formas persistentes de PPC son aparentemente sanos. Estos animales tampoco desarrollan respuesta de anticuerpos, siendo indetectables por los métodos serológicos recomendados para diagnóstico. Los animales persistentemente infectados con VPPC también son refractarios a la vacunación. En la forma persistente congénita de PPC, esto ha sido asociado a inmunotolerancia, debido al fallo del sistema inmune fetal en el reconocimiento del patógeno tras la infección. El conocimiento de los mecanismos que subyacen estas formas de PPC será crucial para el diseño de nuevas herramientas diagnosticas o estrategias antivirales para lograr el control de la PPC.

La presente tesis se enfocó en elucidar los mecanismos virológicos e inmunológicos involucrados en el establecimiento y mantenimiento de infección persistente congénita y postnatal por el VPPC. Con este fin, cerdas preñadas fueron infectadas con cepas de VPPC de diversos grados de virulencia, en un momento de la gestación en el que se ha reportado la inducción de persistencia congénita. Se determinó que la virulencia de la cepa infectante juega un papel importante para la transmisión trans-placentaria, ya que las cepas de alta y moderada virulencia fueron transmitidas más eficientemente a través de esta ruta que la cepa de baja virulencia de VPPC. Además, la cepa de moderada virulencia fue capaz de generar persistencia congénita con VPPC en lechones. Adicionalmente, se encontró evidencia de reconocimiento del patógeno e inducción de respuesta inmune innata, en términos de interferón alfa (IFN- α) por los fetos y lechones. Este resultado contrastó con la definición generalmente reconocida del fenómeno de inmunotolerancia y la infección persistente con VPPC. El papel de la edad en el establecimiento de infección persistente postnatal con VPPC fue estudiado infectando cerdos a edad de destete con una cepa de moderada virulencia. Infección persistente postnatal fue inducida en algunos de estos animales, sin embargo, la proporción de cerdos persistentemente infectados fue más baja que estudios anteriores en los cuales la infección fue llevada a cabo durante las primeras horas después del nacimiento. Esto sugiere fuertemente que la edad a la que se infecta el animal juega un papel en la inducción de la forma persistente postnatal de PPC. Marcadores de estados inmunes alterados fueron detectados en los animales persistentemente infectados. Finalmente, se encontró que poblaciones celulares precursoras, las cuales se encuentran aumentadas en animales persistentemente infectados con VPPC, son similares en fenotipo y funcionalidad a poblaciones celulares inmunosupresoras reportadas anteriormente en humanos. Los resultados de la presente tesis ayudan a entender las bases virológicas e inmunológicas de la persistencia viral causada por VPPC. Es posible que los animales que padecen las formas postnatales persistentes puedan ser usados como un modelo para ayudar en el estudio de los mecanismos de evasión de la respuesta inmune implicados en enfermedades de sanidad animal y humana.

Classical swine fever (CSF) remains one of the most important diseases in animal health, being included into the list of notifiable diseases for the World Organisation for Animal Health (OIE). It is caused by the CSF virus (CSFV), a member of the Pestivirus genus within the Flaviviridae family. Due to the major consequences of CSF, in socio-economical terms, the control of the disease in endemic countries is considered a task of great importance. One of the challenges for disease control is the presence of persistent forms of CSF in the field, which can be congenital or postnatal. Animals that develop persistent CSF forms will be clinically healthy, while excreting high viral loads. Furthermore, they will not develop antibody response, which will make them undetectable by the currently recommended serological methods for diagnosis. Moreover, CSFV persistently infected animals will be refractory to vaccination. In the case of congenital CSF persistence, this has been linked to immunotolerance, due to a failure in pathogen recognition by the foetus after CSFV infection. The understanding of the mechanisms underlying these forms of CSF will be crucial for the design of new diagnostic tools or antiviral strategies to achieve CSF control. The present thesis focused in the elucidation of the virological and immunological mechanisms involved in the establishment and maintenance of congenital and postnatal persistent CSFV infection. To this end, pregnant sows were infected with CSFV strains of varying degrees of virulence at a time point in which congenital persistent infection has been reported to be induced. The virulence of the infecting strain was found to play a major role for trans-placental transmission, as high and moderate virulence strains showed more efficient trans-placental transmission than low virulence CSFV. Moreover, the moderate virulence strain was able to generate congenital viral persistence in piglets. In addition, evidence of pathogen recognition and induction of innate immune response, in terms of Interferon alpha (IFN-α) by the foetuses and piglets was found. This was in contrast with the generally acknowledged definition of the immunotolerance phenomenon and CSFV congenital persistent infection. The role of age in the establishment of postnatal persistent infection with CSFV was also assessed by infecting piglets at weaning age with a moderately virulent CSFV strain. Postnatal persistent infection was generated in some of these animals, however, the proportion or persistently infected pigs was found to be lower than previous experiments in which infection was carried out in the first hours after birth. This strongly suggests the role of age for the induction of CSF postnatal persistent form. Markers of altered immune states were detected in the persistently infected animals. Finally, precursor cell populations found to be increased in CSFV persistently infected animals were determined to be similar, in phenotype and functionality, to immunosuppressive cell populations previously reported in humans. The results of the present thesis provide insight into the virological and immunological basis of viral persistence in CSFV. It is possible that CSFV postnatal persistently infected pigs could be used as a model which can aid in the study of immune evasion pathways implicated in human and animal diseases.