Regulació i funció en resposta a diferents tipus d’estrès de la CaMKK Ckk2

Abstract

Les proteïnes de la família de les CaM quinases (CAMK en anglès), l’activitat de les quals és dependent del complex calci-calmodulina, estan implicada en funcions cel·lulars com la regulació de l’expressió gènica, la contracció, l’apoptosi i en la neurotransmissió. A S. pombe, s’ha descrit una proteïna homòloga a CaMKI de mamífers, Cmk1, que és fosforilada per una quinasa upstream, Ckk2, que és homòloga a la CaMKK de mamífers. Es va observar que l’expressió de Ckk2 en condicions de deprivació nutricional com absència de nitrogen o glucosa s’incrementava. El tractament amb drogues com latrunculina B, que causa alteracions dels microfilaments d’actina, compromet la viabilitat de la soca sense ckk2 (Δckk2). Es van identificar possibles substrats en un assaig de fosfo-proteòmica com Cgs1, subunitat reguladora del complex PKA a S. pombe; Int6, homòloga a la subunitat E del complex eIF3, implicat en la traducció; i Gad8, substrat del TORC2 (TOR complex 2). En aquest treball, s’ha identificat que la funció de Ckk2 és diferent segons el tipus d’estrès, en la deprivació de nitrogen no és important per mantenir la viabilitat però si participa en la re-entrada al cicle cel·lular des de la fase G0. En el cas de la deprivació nutricional de glucosa, la soca Δckk2 mostra una reducció de viabilitat en créixer en condicions de deprivació de glucosa, indicant que podria estar participant en la supervivència en aquestes condicions o que podria ser important per activar mecanismes de restricció calòrica. S’ha observat també que l’increment de l’expressió causat per la deprivació nutricional, retorna a nivells basals en reintroduir els nutrients en el medi, indicant que estava restringit a les condicions de deprivació. L’increment de l’expressió en condicions de deprivació es devia a que en aquestes condicions TORC1 es troba deprivat, i s’ha observat que la inhibició de TORC1 amb rapamicina causa un increment en els nivells de Ckk2. L’augment de l’expressió de Ckk2 en deprivació de nitrogen, es produeix gràcies a la acció de Gaf1, un factor de transcripció que es torna actiu en aquestes mateixes condicions, ja que en absència de Gaf1, l’expressió de Ckk2 no s’indueix amb la mateixa intensitat. No es va detectar la fosforilació dels substrats Cgs1, Int6 i Gad8, però si que es van identificar fosforilacions en proteïnes que co-precipiten amb elles. En analitzar les interaccions genètiques entre Ckk2 i aquests possibles substrats, s’ha observat que el doble mutant Δckk2 Δpka1 presenta un fenotip de letalitat sintètica en condicions de deprivació de glucosa, el que ens indica que la funció de les dos proteïnes és necessària per sobreviure en aquestes condicions i potser convergeixen en una tercera que encara desconeixem. També s’ha observat que l’activitat proteosòmica de Int6 podria estar controlant els nivells de Ckk2 en condicions normals. L’anàlisi de la viabilitat en resposta a latrunculina va demostrar que la funció de Ckk2 no està relacionada amb la de Cmk1, i que podria presentar altres substrats. La composició d’actina en cèl·lules Δckk2 es veu alterada en deprivació de nitrogen, formant nòduls corticals més petits i dispersos. La formació d’aquests nòduls es veu alterada en mutants endocítics i la latrunculina B és capaç d’inhibir l’endocitosi. L’addició de sorbitol, que facilita l’endocitosi, és capaç de revertir la sensibilitat de la soca Δckk2 a la latrunculina B, indicant que Ckk2 podria estar participant en l’endocitosi.

CaMK are proteins whose activity depends on the calcium-calmodulin complex, who are implicated in different cellular functions like contraction, apoptosis, neurotransmission and gene expression. In S. pombe, it has been described a homologue of the mammal CaMKI, Cmk1, which is phosphorylated by an upstream kinase Ckk2 (which is a homologue for CaMKK). It has been observed that under nutrient deprivation caused by depletion of nitrogen or glucose, Ckk2 expression is increased. Treatment with cytoskeleton altering drugs like latrunculin B (LatB) compromises viability of strains without Ckk2 (Δckk2). Possible substrates of Ckk2 have been identified in a phosphoproteomic assay, like Cgs1, Int6 and Gad8. In this thesis, it has been determined that Ckk2 function depends on the stress; for example, Ckk2 is not important to maintain viability in G0 phase, but it is important in the re-entry of cell cycle from G0. Ckk2 could be participating in the response to glucose starvation, as Δckk2 strains show sensitivity in low glucose concentration. Changes in the expression of Ckk2 are restricted to starvation conditions, as the protein level rapidly decreases when nutrients are re-introduced in the media. Ckk2 increase under nutrient starvation is caused by TORC1 inhibition, and is also observed when treating cells with rapamycin, a TORC1 inhibitor. It has been identified that Ckk2 expression is caused by Gaf1, a transcription factor that is active during the first hours of nitrogen deprivation. No phosphorylations were caused by Ckk2 in vitro in Cgs1, Int6 or Gad8, but some were observed in co-precipitated proteins. Ckk2 and Pka1 could be participating together in the response to glucose starvation, as the double deletion show a phenotype of synthetic lethality under these conditions. Steady state levels of Ckk2 might be controlled by proteosomic activity of Int6. Genetic interaction analysis of deletions of CAMK pathway in the response to LatB revealed that targets other than Cmk1 might be involved in the response. Lack of Ckk2 causes alterations in the formation of actin cortical patches under nitrogen starvation and sorbitol treatment is able to rescue Δckk2 mutants from sensitivity to LatB, indicating a possible role for Ckk2 in endocytosis.