Descubrimiento de fármacos contra la enfermedad de Alzheimer basados en la estabilidad de la transtiretina

Abstract

La enfermedad de Alzheimer es la principal causa de demencia. Es una enfermedad neurodegenerativa para la cual no existe tratamiento curativo. La transtiretina (TTR) es una proteína tetramérica conocida por su función transportadora de la hormona tiroidea T4 y del retinol. También posee una función neuroprotectora que está avalada por numerosos estudios in vitro e in vivo, tanto de nuestro grupo como de otros grupos internacionales. Nuestro consorcio de investigación descubrió hace unos años que la estabilización del tetrámero de la TTR, mediante moléculas pequeñas, entre ellas nuestra molécula líder, el Iododiflunisal (IDIF), jugaba un rol importante en la patogénesis del Alzheimer.

Esta tesis doctoral se enmarca en un proyecto multidisciplinar de descubrimiento de fármacos para el Alzheimer, financiado por la Fundación Marató de TV3, cuyo objetivo principal es identificar nuevos estabilizadores de la unión entre TTR y péptidos amiloide Abeta (Aβ) como el IDIF.

Los objetivos específicos son:

a)Optimizar la producción de proteína recombinante humana TTR para obtener cantidades suficientes para su uso en estudios de cribado de alto rendimiento de moléculas pequeñas

b)Investigar las bases estructurales de las interacciones entre la TTR y diferentes péptidos amiloides, utilizando diversas moléculas que estabilizan la TTR.

c)El diseño de un ensayo in vitropara el cribado de alto rendimiento (High Throughput Screening, HTS) de moléculas pequeñas, como potenciales chaperonas de la interacción TTR/Aβ

d)El descubrimiento de nuevas chaperonas de la interacción TTR/Aβ como potenciales candidatos a fármacos, gracias al cribado HTS de moléculas propuestas por otros grupos del consorcio.

En esta tesis se ha optimizado la producción de la proteína humana recombinante TTR, a gran escala (>600 mg), para su posterior uso en estudios estructurales y en ensayos de cribado de moléculas. Mediante la técnica de calorimetría de valoración isotérmica (ITC), se ha confirmado la base estructural de la interacción binaria de la TTR con el péptido amiloide Aβ(1-42), y del efecto estabilizador de IDIF en esta interacción. Se ha diseñado y validado un ensayo de cribado de alto rendimiento (HTS),basado en una técnica turbidimétrica que utiliza Aβ(12-28). Estudios complementarios (fluorescencia de Tioflavina T y de ITC) han corroborado esta validación. Con este ensayo se ha realizado el cribado in vitro de cada una de las 53 moléculas (experimental hits) propuestas por otros grupos de nuestro consorcio, obteniéndose una lista priorizada de compuestos estabilizadores. Ensayos de fluorescencia de Tioflavina T y estudios de calorimetría han corroborado la selección de estas chaperonas. Entre las mejorescabe destacar la presencia de: nuestra molécula IDIF, una molécula en fase de descubrimiento; la luteolina, producto natural que es un fármaco investigacional en fase clínica; y tres fármacos aprobados para otras enfermedades, el sulindac, la olsalazina y el ácido flufenámico, fármacos que pueden ser directamente reposicionados para su uso en fases clínicas para la enfermedad de Alzheimer. Se espera que estudios in vivo en ratones transgénicos modelos de la enfermedad de Alzheimer permitan en un futuro validar la transtiretina como diana terapéutica para el tratamiento de esta enfermedad.

Alzheimer’s disease (AD) is the main cause of dementia. There is currently no cure for this neurodegenerative disease. Transthyretin (TTR) is a tetramericprotein known for its transporting function of thyroid hormone T4 and retinol. It also has a neuroprotective function that is supported by numerous in vitro and in vivo studies, both from our group and other international groups. Our research consortium discovered a few years ago that TTR tetramer stabilization using small-molecules, among them our lead molecule iododiflunisal (IDIF), played an important role in Alzheimer’s pathogenesis.

This doctoral thesis is part of a multidisciplinary drug discovery project for Alzheimer’s disease, funded by Fundació La Marató de TV3, with the aim of identifying potent TTR stabilizers behaving as our stabilizer IDIF enhancing the interaction between TTR and amyloid beta (Aβ) peptides.

The specific objectives are:

a)Optimize the production of human recombinant protein TTR to obtain enough amounts for high-throughput screening (HTS) studies of small-molecules.

b)Investigate the structural basis of the interactions between TTR and different amyloid peptides, using diverse molecules that stabilize TTR.

c)The design of an in vitro test for the high-throughput screening of small molecules as potential chaperones of the TTR/Aβinteraction.

d)The discovery of new chaperones of TTR/Aβinteraction as potential drug candidates.

In this PhD thesis we have optimized the large-scale production of the recombinant human protein TTR (>600 mg) for later use in the structural studies and molecule screening assays. Using the isothermal titration calorimetry (ITC) technique, the structural basis of the binary interaction of TTR with Aβ(1-42) has been confirmed as well as the stabilizing effect of IDIF on this interaction. A high throughput screening (HTS) test, based on turbidimetric techniques, has been designed and validated using the short amyloid peptide Aβ(12-28). Complementary studies (Thioflavin T fluorescence assays and ITC studies) have corroborated this validation. Using this in-house designed HTS assay we have carried out the in vitroscreening of 53 molecules (experimental hits) proposed by our collaborators in the consortia. A prioritized list of molecules has been found. Thioflavin T fluorescence assay and calorimetry studies have corroborated the selection on the chaperones from this prioritized list. Among the best chaperones we have: our molecule IDIF, a molecule in the discovery phase; the natural product luteolin, an investigational drug in clinical phases; and three registered drugs for other diseases, sulindac, olsalazine and flufenamic acid, drugs that can be directly repositioned for use in clinical phase for Alzheimer’s disease. By further in vivo studies with these drugs in animal models of Alzheimer’s disease we will validate transthyretin as a therapeutic target for Alzheimer’s disease therapeutics.