Estructura y determinantes funcionales de selectividad de sustrato de los transportadores HAT para aminoácidos neutros

Abstract

Los transportadores heteroméricos de aminoácidos (HAT) se encuentran compuestos por una subunidad pesada que dirige el tráfico del transportador a la membrana plasmática y la subunidad ligera que posee la actividad catalítica. Cada uno de sus miembros ha evolucionado para reconocer y transportar una serie de aminoácidos específicos, lo cual les confiere un papel fisiológico cuya alteración se ha visto relacionada con diferentes patologías humanas; cáncer, aminoacidurias, sordera asociada a la edad o autismo. De la aplicación de inhibidores que reconozcan estos transportadores de manera específica y de la comprensión de cómo una mutación afecta a su actividad radica la importancia de caracterizar estructural y funcionalmente estos transportadores. Hasta hace muy pocos años la información estructural publicada de los HATs se reducía a modelos atómicos construidos a partir de homólogos bacterianos lejanos y una estructura de h4F2hc/LAT2 resuelta a 21 Å. No obstante, en los 2 últimos años, se han resuelto varias estructuras de un LAT bacteriano y de hasta tres HATs diferentes, incluyendo uno en varias conformaciones, en presencia y ausencia de sustrato. Durante esta tesis se ha realizado un cribado de varios HATs, con el objetivo de encontrar aquel que mejor balance presentara entre un alto nivel de expresión y purificación, y una homogeneidad y estabilidad suficientes para realizar un estudio estructural en crio-microscopía electrónica. Tal estudio resultó en la resolución de la estructura de 4F2hc/LAT2 humano a una resolución de 3,7 Å con el núcleo transmembranal de LAT2 resuelto en un rango entre 2,5 y 3 Å. El análisis de la estructura de 4F2hc/LAT2, junto con una aproximación multidisciplinar, ha permitido establecer las bases del diferente perfil de selectividad mostrado por los transportadores HAT de aminoácidos neutros (LAT2, LAT1 y Asc1). De este modo, la información estructural existente (LAT1 y LAT2 humanos) junto con los estudios funcionales llevados a cabo para LAT2 y Asc1 humanos y los análisis de simulación con sustratos realizados en LAT2 humano permitieron identificar los residuos clave para la diferente selectividad de sustrato dentro de los transportadores HAT de aminoácidos neutros. Por otro lado, el análisis estructural de las mutaciones identificadas en LAT2 asociadas a sordera temprana y cataratas en pacientes determinaron que la región entre el dominio transmembrana 2 (TM2) y el bucle intercelular 1 (IL1) resultaría clave en la configuración del sitio de unión al sustrato. De esta manera, proponemos que las conexiones de regiones cercanas al sitio de unión con el TM2 y el IL1 resultarían clave en la conformación espacial de los residuos clave para el reconocimiento de sustrato y que han sido identificados en el transcurso de esta tesis. Así, pequeños cambios en las interacciones entre estas regiones que se observan en el análisis de secuencia de los diferentes HATs podrían explicar, al menos en parte, el perfil de selectividad de sustrato observados para los diferentes subgrupos de transportadores HAT. Nuestros resultados abren la puerta para identificar los mecanismos moleculares de selectividad de sustratos de los transportadores HAT tanto en el lugar de unión al sustrato como en una región que determina la conformación de este lugar de unión.