Nanotechnology-mediated strategies targeting cancer stem cells for advanced cancer treatment

Abstract

Despite the latest advances in early diagnosis and increased resources employed to develop new therapeutic options, effective control of cancer disease remains a challenge. In fact, cancer is the second leading cause of death and represents a huge economic impact on global health. Furthermore, currently available therapies exhibit limited efficacy for metastasis, being advanced cancer still considered an incurable disease. In this context, it has been shown that metastatic spread, resistance to treatment, as well as aggressiveness of recurrent disease are supported by the presence of cancer stem cells (CSC) within the tumors, a small cell subpopulation that have the ability to regenerate them after chemo- or radiotherapy. Indeed, CSC are intrinsically drug-resistant, thus being responsible for many therapeutic failures. Therefore, in order to increase cancer patient survival, the development of new therapeutic strategies specifically targeting the CSC compartment is required to successfully overcome drug resistance and prevent subsequent tumor relapse. On the other side, conventional chemotherapy produces high systemic toxicity and presents dose-limiting issues due to its low solubility. Thus, difficulties in achieving the required efficacy in the clinical settings are common. Fortunately, tumors can act as therapeutic targets and be passively reached by nanomedicines through the well-known enhanced permeability and retention (EPR) effect. Hence, nanotechnology-based therapies with oncological indications have grown considerably in recent decades, increasing the number of approved products by regulatory agencies, as well as those enrolled in clinical trials. In this regard, the use of nanoparticles as nano-sized drug delivery systems (nano-DDS) is a potential option that provides the opportunity to increase the therapeutic efficacy of loaded agents, reduce harmful side effects and, most importantly, specifically target and eradicate the CSC fraction. Noteworthy, depending on the nano-DDS nature, it is possible to deliver a wide range of payloads, improving their pharmacokinetic patterns while evading the CSC characteristic resistance mechanisms and, consequently, achieving higher drug intracellular accumulation. In particular, polymeric micelles (PM) are nano-DDS widely used in the biomedical field due to their high stability, increased cargo bioavailability, biocompatibility and biodegradability. Moreover, PM can be manufactured through a simple and economic production method, which can be easily scaled-up for future clinical implementation.

Therefore, aiming to specifically eliminate the CSC subset, previous studies performed in our laboratory group were focused on the identification of characteristic CSC targets, namely the arachidonate 5-lypoxigenase (ALOX5) enzyme and the structural maintenance of chromosomes 2 (SMC2) protein. Herein, we have designed and developed two new anti-CSC therapeutic strategies based on blocking key molecular

pathways essential for CSC survival and proliferation, through the ALOX5 and SMC2 inhibition. In addition, combination therapy, which simultaneously eradicates both CSC and bulk tumor cells subpopulations, has also been assessed.

Specifically, two anti-CSC subpopulation therapeutic strategies have been developed, namely i) pharmacological approach, with the ALOX5 chemical inhibitor ZileutonTM; and ii) biotherapeutic approach, where the specific SMC2 blockade is achieved with antibodies anti-SMC2 (Ab-SMC2) protein. Aiming to allow their solubilization and to protect therapeutic agents from degradation, Pluronic® F127-based PM were designed to encapsulate ZileutonTM (PM-ZileutonTM) and Ab-SMC2 (PM-CON:SMC2). Both formulations were physicochemically characterized, and preclinically validated in vitro and in vivo breast and colon cancer models. The obtained results demonstrated that both proposed anti-CSC therapeutic strategies, PM-ZileutonTM and PM-CON:SMC2, improve their effectiveness in vitro compared to their free anti-cancer agent, particularly in the challenging fraction of CSC. Importantly, when conventional treatments showed strong resistance, both formulations were substantially effective in terms of cell viability reduction and colony formation impairment. Further, thanks to the great structural versatility provided by Pluronic® F127-based PM it was possible to perform combination therapy, mixing PM-CON:SMC2 with conventional chemotherapeutics such as Paclitaxel (PTX) and 5-Fluorouracil (5-FU) to treat not only the primary tumor, but also the resultant metastasis by targeting both CSC and differentiated tumor cells, respectively. Notably, the combined micelles showed higher efficacy than their free forms in terms of inhibition of tumorspheres formation. In addition, due to the preferred accumulation of PM at the tumor site and the specificity of ZileutonTM in CSC elimination, a significant intratumoral decrease of CSC in vivo after PM-ZileutonTM treatment was observed. Moreover, our results also showed a strong reduction of circulating tumor cells (CTC) and CSC in blood stream, and subsequent reduction of intravasation and invasion capacity of CSC, resulting in a significant reduction of lung metastasis in highly resistant MDA-MB-231 BC model. In conclusion, our data clearly suggest the anti-metastatic potential of PM- ZileutonTM, the effective intracellular release of antibodies targeting SMC2 protein and, furthermore, the opportunity to offer a multifunctional delivery system nanoplatform to improve overall therapeutic outcomes of metastatic cancer.

Tot i els darrers avenços en el diagnòstic precoç i l’augment de recursos emprats per a desenvolupar noves opcions terapèutiques, el control eficaç de la malaltia del càncer continua sent un repte. De fet, el càncer és la segona causa de mort arreu del món i representa un gran impacte econòmic pel que fa a la salut mundial. A més, les teràpies disponibles a dia d’avui presenten una eficàcia limitada per al tractament de les metàstasis, fent del càncer avançat una malaltia incurable. En aquest context, s’ha demostrat que la difusió metastàtica, la resistència al tractament i l’agressivitat dels tumors recurrents són degudes a la presència de cèl·lules mare del càncer (CMC) dins dels tumors, una petita subpoblació de cèl·lules que té la capacitat de regenerar-los després dels tractaments amb quimio- o radioteràpia. De fet, les CMC són intrínsecament resistents als fàrmacs i, per tant, responsables de molts dels fracassos terapèutics. Així, amb la finalitat d’incrementar la supervivència dels pacients amb càncer, és necessari el desenvolupament de noves estratègies terapèutiques dirigides específicament a la subpoblació de CMC, per a poder superar amb èxit la resistència farmacològica i, així, evitar la posterior recaiguda de la malaltia. D’altra banda, la quimioteràpia convencional produeix una alta toxicitat sistèmica a més de presentar limitacions a l’hora d’administrar-la degut a la seva baixa solubilitat. Per tant, són freqüents les dificultats per a aconseguir l’eficàcia necessària a la pràctica clínica. Afortunadament, els tumors poden actuar com a dianes terapèutiques i ser assolits passivament per les nanomedicines mitjançant el conegut efecte de permeabilitat i retenció millorada. És per aquest motiu que les teràpies basades en nanotecnologia amb indicacions oncològiques han crescut considerablement en els últims temps, augmentant tant el nombre de productes aprovats per les agències reguladores, com els inscrits a assajos clínics. Així, l’ús de nanopartícules com a sistemes de subministrament de fàrmacs de mida nanomètrica (nano-DDS) possibilita l’increment de l’eficàcia terapèutica dels agents anticancerígens administrats, reduint els efectes secundaris nocius i, el més important, eliminant específicament la fracció de CMC de dins dels tumors. És important destacar que segons la naturalesa dels nano-DDS és possible administrar una àmplia gamma de molècules terapèutiques, millorant els seus patrons farmacocinètics tot evitant els mecanismes de resistència característics de les CMC i, en conseqüència, aconseguir una major acumulació intracel·lular dels fàrmacs. Concretament, les micel·les polimèriques (MP) són nano-DDS àmpliament utilitzats al camp biomèdic degut a la seva elevada estabilitat, biocompatibilitat i biodegradabilitat. Altrament, aquestes nanopartícules es poden fabricar mitjançant un mètode de producció senzill, econòmic i fàcilment escalable per a una futura implementació clínica.

Així, amb l’objectiu d’eliminar específicament el subconjunt de CMC, els estudis previs realitzats al nostre grup de laboratori es van centrar en la identificació de dianes terapèutiques característiques de les CMC, com ara són l’enzim arachidonat 5- lipoxigenasa (ALOX5) i la proteïna structural maintenance of chromosomes 2 (SMC2). En aquest treball, hem dissenyat i desenvolupat dues estratègies terapèutiques anti- CMC basades en el bloqueig de vies moleculars essencials per a la seva supervivència i proliferació, mitjançant la inhibició de l'ALOX5 i SMC2. També s’ha avaluat la teràpia combinada per tal de valorar l’efecte de l’erradicació simultània, eliminant d’aquesta manera tant la fracció de CMC, com les cèl·lules tumorals diferenciades.

Les estratègies proposades es fonamenten en dos mètodes d’inhibició diferenciats, concretament: i) l’opció farmacològica, amb l’inhibidor químic de l’ALOX5, el ZileutonTM; i ii) l’opció bioterapèutica, on el bloqueig específic de la proteïna SMC2 s’aconsegueix mitjançant anticossos anti-SMC2 (Ab-SMC2). En tots dos mètodes, s’han utilitzat MP produïdes amb el polímer amfifílic Pluronic® F127 per tal de millorar la solubilització de les molècules anti-CMC emprades, així com protegir-les d’una degradació prematura. D’aquesta manera, les micel·les s’han dissenyat per a encapsular el ZileutonTM i els Ab- SMC2, donant lloc a PM-ZileutonTM i PM-CON:SMC2, respectivament. Les dues formulacions es van caracteritzar fisicoquímicament i es van validar preclínicament en models de càncer de mama i còlon in vitro i in vivo. Els resultats obtinguts van demostrar que les dues estratègies terapèutiques anti-CMC proposades milloren la seva efectivitat in vitro en comparació amb el seu agent anticancerigen lliure, particularment a la fracció de les problemàtiques CMC. A més, quan els tractaments utilitzats regularment a la pràctica clínica van mostrar una forta resistència, ambdues formulacions van resultar ser significativament efectives pel que fa a la viabilitat cel·lular i impediment en la formació de colònies. D’altra banda, gràcies a la gran versatilitat estructural proporcionada per les MP de Pluronic® F127, es va poder provar l’efecte de la teràpia combinada barrejant PM-CON:SMC2 amb quimioteràpies d’ús convencionals com ara el Paclitaxel (PTX) i el 5-Fluorouracil (5-FU), amb l’objectiu de no només tractar el tumor primari, sinó també la metàstasis resultant tot dirigint-nos tant a les CMC com a les cèl·lules tumorals diferenciades, respectivament. Cal assenyalar que les micel·les combinades van mostrar una eficàcia superior a les seves formes lliures respecte a la inhibició de la formació d’esferes tumorals, model de creixement específic de les CMC. A més, degut a l'acumulació preferencial de les MP a la regió tumoral i l'especificitat del ZileutonTM eliminant les CMC, es va poder observar una disminució intratumoral significativa de CMC in vivo en models de càncer de mama després del tractament amb PM-ZileutonTM. Els resultats també van mostrar una forta reducció de cèl·lules tumorals

circulants (CTC) i CMC al torrent sanguini, donant lloc a una posterior reducció en la capacitat d’invasió de les CMC i, per tant, una disminució significativa de les metàstasis pulmonars al model de càncer de mama MDA-MB-231 altament resistent. Com a conclusió, les nostres dades demostren el potencial anti-metastàtic de les PM- ZileutonTM, així com un eficaç alliberament intracel·lular d’anticossos dirigits a la proteïna SMC2, a més d’oferir l’oportunitat de crear una nanoplataforma multifuncional, com a sistema d’administració, per tal de poder millorar els resultats terapèutics globals del càncer metastàtic.