Three-dimensional organization of HP1c-complex target genes

Abstract

It has been previously shown that the Drosophila heterochromatin protein 1c (HP1c) forms a complex with the transcription factors (TF) WOC and ROW, and the extraproteasomal ubiquitin receptor dDsk2. The HP1c-complex localizes at the transcription start site (TSS) of active genes and regulates RNApol II pausing. Previous work also showed that the HP1c-complex interacts with the architectural proteins Z4, Chromator and BEAF-32, which are involved in the regulation of the three-dimensional (3D) organization of the genome inside the nucleus. In this work, we have analyzed the 3D organization of HP1c-complex target genes and studied the contribution of the architectural protein Z4. HiChIP experiments performed with αROW antibodies show that HP1c-complex target genes are extensively involved in 3D interactions with non-target genes, forming clusters of high connectivity (HCRROW). Genes within these clusters are expressed and, although the average expression of genes in different HCRROW clusters is similar, dispersion of the expression levels of genes within each cluster is lower than respect to the genes in the rest of clusters, suggesting that gene expression within HCRROW clusters is coordinated. Our results also show that the architectural protein Z4 stabilizes 3D organization of HP1c-complex target genes since its depletion reduces αROW HiChIP interactions. Unexpectedly, we observed that Z4 has an opposite effect when 3D interactions are studied by whole-genome HiC. We show that 3D interactions of HP1c-complex target regions, which decreased intensity in αROW HiChIP experiments upon Z4 depletion, show increased intensity in HiC experiments. These results suggest that, in contrast to HiC experiments that interrogate 3D interactions in the whole population of cells, αROW HiChIP experiments capture the interactions in only a minor subpopulation, in which ROW is actually bound. Therefore, while Z4 stabilizes the interactions when ROW is bound, it has the opposite effect when ROW is not bound. Further analysis of HiC data showed that Z4 depletion results in a general increase of short-range 3D interactions, including interactions between active (A) compartments, gene loop interactions and Polycomb (Pc) loop interactions. Similar effects where observed in Z4-depleted cells subjected to hyperosmotic stress. We observed that, while in control cells hyperosmotic stress causes a general loss of 3D interactions that swiftly recover after stress release, in Z4-depleted cells 3D interactions were more resistant to hyperosmotic stress and recovered to a higher intensity upon stress release. Interestingly, we also observed that Z4 antagonizes pairing between homologous chromosomes, as cells lacking Z4 show increased pairing. A similar behavior was reported earlier for the condensin subunit CapH2. As a matter of fact, co-IP experiments provide support for the interaction between Z4 and CapH2. Moreover, ChIP-seq experiments show that Z4 extensively co-localizes with CapH2 and that CapH2 chromatin binding depends on Z4. These results suggest that Z4 and CapH2 co-operate to prevent chromosome pairing. Notably, we observed that hyperosmotic stress abolishes chromosome pairing. Altogether these results suggest a link between chromosome pairing and 3D interactions since conditions that favor pairing (ie, Z4 depletion) reinforce 3D interactions, while conditions that inhibit pairing (ie, hyperosmotic stress) weaken 3D interactions.

Estudios anteriores demostraron que la proteína HP1c de Drosophila forma un complejo con los factores de transcripción WOC y ROW, y el receptor extraproteosomal de ubiquitina dDsk2. El complejo HP1c se localiza en el sitio de inicio de la transcripción de genes activos y regula la pausación de la RNApol II. Dichos estudios también mostraron que el complejo HP1c interactúa con las proteínas de arquitectura Z4, Chromator y BEAF-32, que participan en la regulación de la organización tridimensional (3D) del genoma dentro del núcleo. En este trabajo, hemos analizado la organización 3D de los genes diana del complejo HP1c y hemos estudiado la contribución de la proteína de arquitectura Z4. Experimentos de HiChIP realizados con anticuerpos αROW muestran que los genes diana del complejo HP1c están ampliamente involucrados en interacciones 3D con genes no diana, formando grupos de alta conectividad (HCRROW). Los genes dentro de estos grupos se expresan y, aunque la expresión promedio de genes en diferentes grupos HCRROW es similar, la dispersión de los niveles de expresión de genes dentro de cada grupo es menor que con respecto a los genes en el resto de grupos, lo que sugiere que la expresión génica dentro de los grupos está coordinada. Nuestros resultados también muestran que la proteína de arquitectura Z4 estabiliza la organización 3D de los genes diana del complejo HP1c, ya que su depleción reduce las interacciones αROW HiChIP. Inesperadamente, observamos que la depleción de Z4 tiene un efecto opuesto cuando las interacciones 3D son estudiadas por HiC. De forma que, mientras que las interacciones 3D de las regiones diana del complejo HP1c disminuyen en intensidad en los experimentos de αROW HiChIP, dichas interacciones aumentan en intensidad en los experimentos de HiC. Estos resultados sugieren que, a diferencia de los experimentos de HiC que interrogan las interacciones 3D en toda la población celular, los experimentos de αROW HiChIP capturan las interacciones sólo en una subpoblación menor, en la que ROW está unido a la cromatina. Por consiguiente, mientras que Z4 estabiliza las interacciones cuando ROW está unido, tiene el efecto opuesto cuando ROW no está unido. El análisis extenso de los datos de HiC mostró que la depleción de Z4 resulta en un aumento general de las interacciones 3D de corta distancia, incluidas las interacciones entre compartimentos activos (A), interacciones génicas de bucle e interacciones Polycomb (Pc) de bucle. Se observaron efectos similares en células deplecionadas para Z4 y sometidas a estrés hiperosmótico. Observamos que, mientras que en las células control el estrés hiperosmótico causaba una pérdida general de interacciones 3D que se recuperaban rápidamente después de la cesión del estrés, en las células deplecionadas para Z4 las interacciones 3D eran más resistentes al estrés hiperosmótico y se recuperaban con intensidades mayores al cesar el estrés. Además, también observamos que Z4 antagoniza el apareamiento entre cromosomas homólogos, ya que las células que carecen de Z4 muestran mayores niveles de apareamiento. Otros estudios previos demostraron un comportamiento similar para la subunidad de condensina CapH2. De hecho, experimentos de co-IP secundan la interacción entre Z4 y CapH2. Además, experimentos de ChIP-seq muestran que Z4 co-localiza ampliamente con CapH2 y que la unión de CapH2 a cromatina depende de Z4. Estos resultados sugieren que Z4 y CapH2 cooperan para prevenir el apareamiento entre cromosomas homólogos. En particular, observamos que el estrés hiperosmótico anula el apareamiento entre cromosomas. En conjunto, estos resultados sugieren un vínculo entre el apareamiento entre cromosomas y las interacciones 3D, ya que las condiciones que favorecen el apareamiento (como por ejemplo, la depleción de Z4) refuerzan las interacciones 3D, mientras que las condiciones que inhiben el apareamiento (como por ejemplo, el estrés hiperosmótico) debilitan dichas interacciones.