Graft Preservation and Ischemia Reperfusion Injury in Liver Transplantation. Studies in Immunomodulation and Attenuation of Injury

Abstract

El transplantament hepàtic es l’única opció terapèutica per als pacients amb cirrosi hepàtica. L’èxit del transplantament hepàtic ha generat una manca d’òrgans i un augment dels pacients en llista d’espera. Malgrat els esforços per augmentar el nombre de donants d’òrgans, molts d’aquests pacients moren o surten de la llista d’espera sense haver rebut una oferta d’òrgan. Amb l’objectiu de resoldre aquest problema, s’han adoptat polítiques més lliberals d’utilització d’òrgans marginals amb el risc d’empitjorar els resultats post-transplantament. S’entén per òrgans marginals aquells provinents de donants envellits, donació en aturada cardíaca o aquells amb esteatosi. Aquests òrgans marginals toleren malament el període d’isquèmia freda durant la fase de preservació prèvia al transplantament. Això comporta un augment de la mortalitat i morbiditat post-transplantament. La perfusió d’òrgans ex vivo permetria contrarestar les complicacions associades a la utilització d’òrgans marginals. La perfusió d’òrgans ex vivo té potencial per reduir la lesió d’isquèmia-reperfusió, avaluar la funcionalitat dels òrgans i modificar empelts des d’un punt de vista molecular a fi de millorar els resultats després del transplantament. Estudis previs amb porcins i assaigs clínics amb humans han validat diferents tècniques de perfusió com la perfusió hipotèrmica oxigenada, la perfusió normotèrmica i sub-normotèrmica, i la perfusió regional normotèrmica amb màquina extra-corpòria. Cadascuna d’aquestes tècniques té avantatges i inconvenients i es troben sota estudi per determinar la seva idoneïtat segons les característiques de l’òrgan a reperfondre. El mètode òptim de perfusió hepàtica ex vivo encara no està definit. Malgrat els diferents treballs realitzats amb porcins i assaigs clínics en humans, la comparació directa dels diferents mètodes de perfusió no s’ha dut a terme. La utilització d’agents antiinflamatoris a temperatura sub-normotèrmica podria millor l’efecte protector de la perfusió d’òrgans ex vivo. D’altra banda, l’ús de vasodilatadors durant la preservació ex vivo de l’empelt mitjançant les diferents tècniques de perfusió tampoc no ha estat comparada. Diferents agents vasodilatadors com el BQ123, l’epoprostenol i el verapamil reverteixen el vasoespasme arterial hepàtic causat per les solucions fredes de preservació i atenuen la lesió d’isquèmia-reperfusió. Encara queda per definir quin és l’agent vasodilatador amb el millor perfil d’eficàcia i seguretat pel seu ús durant la perfusió ex vivo. L’objectiu d’aquest treball de tesi fou l’estudi de diferents estratègies antiinflamatòries i la comparació dels diferents agents vasodilatadors utilitzats de forma rutinària en models porcins de perfusió hepàtica ex vivo. Durant la primera fase d’aquest estudi, es comparà un grup amb model de perfusió utilitzat en assaigs clínics en humans amb un model antiinflamatori de perfusió sub-normotèrmia amb alprostadil, n-acetilcisteÏna, monòxid de carboni i sevoflurà. Els fetges preservats amb el model antiinflamatori mostraren menys lesió d’isquèmia-reperfusió i millors resultats post-transplantament en comparació amb el grup amb model de perfusió estàndard. En una segona fase de l’estudi, es compararen tres vasodilatadors utilitzats en assaigs clínics (BQ123, epoprostenol i verapamil). La utilització d’aquests agents en models porcins de perfusió hepàtica es va mostrar segura sense causar dany en fetges sans. Els empelts hepàtics perfosos amb BQ123 i verapamil presentaren fluxos arterials més elevats i menor dany hepatocitari i cèl·lules endotelials durant la perfusió ex vivo i període post-transplantament, en comparació amb l’epoprostenol.

El trasplante hepático es la única opción terapéutica para los pacientes con cirrosis. Los buenos resultados de esta técnica quirúrgica han generado una escasez de órganos y un aumento en el número de pacientes en lista de espera. A pesar de los esfuerzos por aumentar el número de donantes, muchos de estos pacientes mueren sin llegar a tener siquiera la oferta de un órgano. Para resolver este problema, se ha incrementado el “pool” de donantes utilizando órganos marginales. Esto aumenta el riesgo de tener resultados sub-óptimos posterior al trasplante. Se denomina órgano marginal a aquellos provenientes de donantes añosos, donantes en parada cardiaca o aquellos con esteatosis. Los órganos marginales toleran mal la isquemia fría durante la preservación antes del trasplante. Esta intolerancia a la preservación fría aumenta la mortalidad y morbilidad post-trasplante. La perfusión ex vivo de órganos ha surgido recientemente como una herramienta con el potencial de limitar las complicaciones asociadas al uso de órganos marginales. La perfusión ex vivo hepática tiene el potencial de disminuir la lesión por isquemia reperfusión, evaluar objetivamente el órgano y modificarlo desde el punto de vista molecular para mejorar su desempeño una vez ha sido trasplantado. Diversos estudios en modelos porcinos y ensayos clínicos en humanos han validado una serie de métodos de perfusión como lo son la perfusión hipotérmica oxigenada, la perfusión normotérmica y sub-normotérmica y la perfusión regional normotérmica con máquina extracorpórea. Cada una de estas técnicas tiene beneficios y limitaciones. Su uso continúa siendo estudiado sin tener claridad sobre cual tiene mejores resultados. El método de perfusión hepática ex vivo ideal no ha sido definido todavía. A pesar de múltiples estudios en modelos porcinos y ensayos clínicos en humanos no existe una comparación directa entre los diferentes métodos de perfusión. Añadir componentes anti-inflamatorios y el uso de temperatura a sub-normotérmica podría mejorar los efectos protectores de la perfusión ex vivo. Por otra parte, el uso de vasodilatadores durante la perfusión no ha sido estudiado en detalle. Se sabe que diferentes vasodilatadores como el BQ123, Epoprostenol y el Verapamilo tienen la propiedad de contrarrestar el vasoespasmo arterial causado por las soluciones frías de preservación. Esta propiedad disminuye la lesión por isquemia reperfusión. El vasodilatador con los mejores resultados esta pendiente de definir. El objetivo de esta tesis doctoral es estudiar la aplicación de estrategias anti-inflamatorias y comparar diferentes vasodilatadores usados de forma rutinaria en modelos porcinos de perfusión hepática ex vivo. En la primera fase del estudio comparamos el modelo de perfusión utilizado en ensayos clínicos en humanos con un modelo anti-inflamatorio añadiendo alprostadil, n-acetilcisteína, monóxido de carbono y sevoflurane. Encontramos que los órganos preservados con el modelo anti-inflamatorio tenían menor lesión por isquemia reperfusión y mejores resultados luego del trasplante una vez comparados con el modelo estandarizado. En la segunda fase del estudio comparamos tres vasodilatadores utilizados en diferentes estudios clínicos; BQ123, Epoprostenol y Verapamilo. Cada uno de los vasodilatadores demostró ser seguro y no generar daños en hígados sanos. Los órganos perfundidos con BQ123 y Verapamilo presentaron mejores flujos a nivel arterial y menor lesión del hepatocito y la célula endotelial una vez comparados con Epoprostenol.

Liver transplantation is the only treatment option for patients with end stage liver disease. The success of liver transplantation has led to organ shortage and increase of waiting list times for patients in need of this precious resource. Despite the efforts to increase the donor pool, many of these patients die or become de listed without even getting an organ offer. To palliate this problem, more liberal policies to use marginal grafts have been implemented with the risk of hampering post-transplant outcomes. These marginal grafts comprise organs from elderly donors, donation after cardiac death, or grafts with steatosis. Marginal grafts tolerate badly static cold storage, increasing post-transplant morbidity and mortality. Ex vivo machine perfusion is a promising tool to limit the complications associated with the use of marginal grafts. Machine perfusion has the potential to reduce preservation injury, assess organ function and modify molecular pathways in the graft to improve post-transplant outcomes. Studies in porcine models and clinical trials have validated different types of perfusion techniques such as hypothermic oxygenated machine perfusion (HOPE), normothermic and sub-normothermic machine perfusion, and in situ normothermic regional perfusion. Each one of these techniques has benefits and limitations and are still under study as to which is better according to the type of organ perfused. The optimal perfusion setup for ex-vivo machine preservation of liver grafts has not been defined yet. Despite numerous studies in porcine models and human clinical trials, no direct comparison has been done using different compositions of the perfusate. Adding anti-inflammatory agents plus sub-normothermic temperature could improve the protective effects of ex vivo organ perfusion. On the other hand, the use of vasodilators during ex vivo graft preservation has not been compared and validated among different perfusion setups. Vasodilators such as BQ123, Epoprostenol, and Verapamil reverse hepatic artery vasospasm caused by static cold storage and attenuate ischemia reperfusion injury. The optimal vasodilator to be used during ex vivo graft preservation with an effective and safe profile is still to be determined. The aim of this doctoral thesis is to study the application of protective anti-inflammatory strategies and to compare different vasodilators used in porcine ex vivo preservation models. In the first phase of the study a group with a standard ex vivo setup used in human clinical trials was compared to a sub-normothermic group with added anti-inflammatory agents such as alprostadil, n-acetylcysteine, carbon monoxide, and sevoflurane. Livers perfused with the anti-inflammatory setup had less ischemia reperfusion injury and better post-transplant outcomes when compared with the standard perfusion setup. Addition of these components further improves warmed perfused preservation. In the second phase of the study, vasodilators used in current clinical trials (BQ123, Epoprostenol, and Verapamil) were compared to determine which one had the safest profile and better outcomes regarding ischemia reperfusion injury. Again, using a porcine ex vivo preservation model three different setups were compared. The use of BQ123, Verapamil, and Epoprostenol as vasodilators during normothermic ex vivo liver perfusion appeared to be safe and not harm standard criteria grafts. Livers perfused with BQ123 and Verapamil had higher hepatic artery flow and reduced endothelial cell and hepatocyte injury during ex vivo perfusion and in the posttransplant period compared to Epoprostenol.