Estudio de caracterización y diagnóstico de la infección aguda y crónica por el virus de la hepatitis E

Abstract

La infecció pel VHE és la causa més comuna d’hepatitis aguda a nivell mundial, amb una morbiditat i mortalitat important en algunes poblacions especials. S’estima que afecta 20 milions de persones anualment. La infecció es presenta com una infecció aguda podent derivar a infecció crònica en pacients no immunocompetents o amb immunodeficiències. El diagnòstic de VHE és clau per identificar les infeccions cròniques i tractar-les a temps abans que causi un dany hepàtic irreversible. El diagnòstic es basa principalment en serologia i càrregues virals en plasma. Actualment el diagnòstic de la infecció aguda en la pràctica clínica es basa en la presència d’IgM en plasma amb ALT elevades. No obstant això, estudis recents afirmen que la IgM podria respondre de manera diferent segons el tipus d’infecció com en el cas de la infecció pel virus de l’hepatitis delta. Els resultats del primer estudi presentat en aquesta tesi doctoral van mostrar que la IgM anti-VHE observada tnat en pacients aguts com crònics setmanes o mesos després de l’inici de la infecció, presenta la forma pentamèrica. A mes, analitzant les càrregues virals en plasma i femta de pacients amb infecció crònica i infecció aguda per VHE, s’ha observat que hi ha diferències significatives entre l’ARN-VHE en plasma i l’ARN-VHE en femta independentment de l’tipus d’infecció, arribant a ser en la majoria de casos més alta la càrrega viral en femta que fa a la mostra de plasma de la mateixa pacient, evidenciant la utilitat de les mostres de femta per a diagnòstic i monitoratge de la infecció. De manera similar al que passa a la infecció pel virus de l’hepatitis B, on l’HBsAg no associat a partícules virals constitueix partícules formades només per embolicades virals en una abundància de fins a 10.000 vegades les partícules virals, sent detectable fins i tot en absència de partícules virals detectables, en l’estudi per gradients de VHE s’ha observat que el VHE-Ag es detecta en totes les mostres si bé amb diferències en la seva distribució segons l’origen de la mostra: en plasma, el VHE-Ag es va detectar en gairebé totes les fraccions de el gradient, suggerint la presència de diferents fragments de la proteïna ORF2 amb diferents densitats, sense necessitat d’estar relacionats amb virions infectius. En canvi, en femta es va observar una clara dissociació entre fragments de ORF2 i partícules virals, dades ja descrites amb anterioritat a la bibliografia i que es van corroborar amb un protocol d’aïllament de vesícules extracel·lulars, el qual va mostrar que els virions de VHE circulen associats a membranes en plasma i es troben de manera majoritària de forma independent en femta. Aquests resultats es van veure recolzats per imatges de microscòpia i criomicroscòpia electrònica. Així mateix, es va utilitzar la Next-generation sequencing per tal de comprovar si aquestes diferències s’observaven a nivell de població viral, demostrant-se que les poblacions virals de plasma i de femta en un mateix pacient són iguals, sense diferències significatives entre infeccions aguda i crònica . Els resultats globals d’aquesta tesi doctoral suggereixen canvis i millores per dur a terme el diagnòstic i tractament de la infecció pel VHE: es suggereix no utilitzar només la detecció d’IgM per tal de diferenciar entre infecció aguda o crònica, i afegir a aquesta la determinació de la càrrega viral en plasma i la detecció de VHE-Ag. També es proposa una nova eina diagnòstica: la femta, les quals afegides a l’ús ja ben estès de l’plasma podrien facilitar el diagnòstic i el monitoratge de les infeccions aguda i crònica pel VHE.

La infección por el VHE es la causa más común de hepatitis aguda a nivel mundial, con una morbilidad y mortalidad importante en algunas poblaciones especiales. Se estima que afecta a 20 millones de personas anualmente. La infección se presenta como una infección aguda pudiendo derivar a infección crónica en pacientes no inmunocompetentes o con inmunodeficiencias. El diagnóstico de VHE es clave para identificar las infecciones crónicas y tratarlas a tiempo antes de que ocurra un daño hepático irreversible. El diagnóstico se basa principalmente en serología y cargas virales en plasma. Actualmente el diagnóstico de la infección aguda en la práctica clínica se basa en la presencia de IgM en plasma con ALT elevadas. Sin embargo, estudios recientes afirman que la IgM podría responder de manera diferente según el tipo de infección como en el caso de la infección por el virus de la hepatitis delta. Los resultados del primer estudio presentado en esta tesis doctoral mostraron que en pacientes con infección aguda como crónica, la IgM anti-VHE que se detecta semanas o meses después del inicio de la infección, tiene forma pentamérica. Asimismo, analizando las cargas virales en plasma y heces de pacientes con infección crónica e infección aguda por VHE, se ha observado que existen diferencias significativas entre el ARN-VHE en plasma y el ARN-VHE en heces independientemente del tipo de infección, llegando a ser en la mayoría de casos más alta la carga viral en heces respecto a la muestra de plasma del mismo paciente, evidenciando la utilidad de las muestras de heces para diagnóstico y monitorización de la infección. De manera similar a lo que ocurre en la infección por el virus de la hepatitis B, dónde el HBsAg no asociado a partículas virales constituye partículas formadas solo por envueltas virales en una abundancia de hasta 10.000 veces las partículas virales, siendo detectable incluso en ausencia de partículas virales detectables, en el estudio por gradientes de VHE se ha observado que el VHE-Ag se detecta en todas las muestras si bien con diferencias en su distribución según el origen de la muestra: en plasma, el VHE-Ag se detectó en casi todas las fracciones del gradiente, sugiriendo la presencia de distintos fragmentos de la proteína ORF2 con diferentes densidades, sin necesidad de estar relacionados con viriones infectivos. En cambio, en heces se observó una clara disociación entre fragmentos de ORF2 y partículas virales, datos ya descritos con anterioridad en la bibliografía y que se corroboraron con un protocolo de aislamiento de vesículas extracelulares, el cual mostró que los viriones de VHE circulan asociados a membranas en plasma y se encuentran de manera mayoritaria de forma independiente en heces. Estos resultados se vieron respaldados por imágenes de microscopía y criomicroscopía electrónica. Asimismo, se utilizó la Next-generation sequencing con el fin de comprobar si estas diferencias se observaban a nivel de población viral, demostrándose que las poblaciones virales de plasma y de heces en un mismo paciente son iguales, sin diferencias significativas entre infecciones aguda y crónica. Los resultados globales de esta tesis doctoral sugieren cambios y mejoras para llevar a cabo el diagnóstico y tratamiento de la infección por el VHE: se sugiere no utilizar la detección de IgM con el fin de diferenciar entre una infección aguda o crónica, y añadir a esta la determinación de la carga viral en plasma y la detección de VHE-Ag. También se propone una nueva herramienta diagnóstica: las heces, las cuales añadidas al uso ya bien extendido del plasma podrían facilitar el diagnóstico y la monitorización de las infecciones aguda y crónica por el VHE.

HEV infection is the most common cause of acute hepatitis worldwide, with significant morbidity and mortality in some special populations. It’s estimated that HEV affects 20 million people annually. The infection presents as an acute infection and can lead to chronic infection in non-immunocompetent or immunodeficient patients. A correct diagnosis of HEV infection is key to identifying chronic infections and treating them early before irreversible liver damage occurs. Diagnosis is based primarily on serology and viral loads in plasma. Currently, the diagnosis of acute infection in clinical practice is based on the presence of IgM in plasma with elevated ALT. However, recent studies show that IgM might respond differently depending on the type of infection as in the case of hepatitis delta virus infection. The results of the first study presented in this doctoral thesis showed that the anti-VHE IgM found in acute and chronic patients, weeks or months after the onset of infection, has a pentameric form. Likewise, analyzing the viral loads in plasma and feces of patients with chronic and acute infection by HEV, it has been observed that there are significant differences between the RNA-HEV in plasma and the RNA-HEV in feces regardless of the type of infection, and in most cases, the viral load in feces was higher than in plasma sample from the same patient, evidencing the usefulness of stool samples for diagnosis and monitoring of infection. Similar to what occurs in hepatitis B virus infection, where HBsAg not associated with viral particles constitutes particles formed only by viral envelopes in an abundance of up to 10,000 times the viral particles, being detectable even in the absence of detectable viral particles, in the study by HEV gradients it has been observed that HEV-Ag is detected in all samples, although with differences in its distribution according to the sample’s origin: in plasma, HEV-Ag was detected in almost all the fractions of the gradient, suggesting the presence of different fragments of the ORF2 protein with different densities, without the need to be related to infective virions. On the other hand, a clear dissociation between ORF2 fragments and viral particles was observed in feces, data previously described in the literature and which were corroborated with a protocol for the isolation of extracellular vesicles, which showed that HEV virions circulate associated with membranes in plasma and are mainly found independently in faeces. These results were supported by electron microscopy and cryomicroscopy images. Likewise, Next-generation sequencing was used in order to check if these differences were observed at viral population level, showing that viral populations of plasma and feces intra patient are the same, without significant differences between acute and chronic infections. The overall results of this doctoral thesis suggest changes and improvements to carry out the diagnosis and treatment of HEV infection: it’s suggested not to use IgM detection to differentiate between acute or chronic infection, and to add to IgM detection the determination of viral load in plasma and detection of HEV-Ag. A new diagnostic tool is also proposed: feces, which, added to the already widespread use of plasma, could facilitate the diagnosis and monitoring of acute and chronic HEV infections.