Mechanistic, temporal and spatial insights of the regulatory network controlling plant responses to vegetation proximity

Abstract

La llum és essencial per a les plantes, no només com a font d’energia per a la fotosíntesi, sinó també com un senyal d’informació ambiental que els permet adaptar el seu desenvolupament per prosperar en diferents escenaris. En les plantes que eviten l’ombra, com Arabidopsis thaliana, la proximitat de vegetació potencialment competidora desencadena un grup de respostes conegut com a síndrome de fugida de l’ombra (SAS, de les seves sigles en anglès), que inclou l’allargament de l’hipocòtil. Els fitocroms, que són els fotoreceptors que detecten els senyals de proximitat vegetal, interaccionen amb els factors de transcripció PHYTOCHROME INTERACTING FACTORS (PIFs). Aquesta interacció resulta en la integració dels senyals de llum i ajusta el desenvolupament de les plantes a aquests canvis ambientals. La hipòtesi actual estableix que la inactivació induïda per l’ombra del fitocrom B (phyB) allibera la repressió imposada sobre els PIFs, el que resulta en canvis ràpids en l’expressió gènica i la promoció de l’allargament de l’hipocòtil.

Els PIFs contenen un motiu d’unió a phyB actiu (APB) i un domini bàsic-hèlix-bucle-hèlix (bHLH), responsable de la unió a l’ADN. Entre els PIFs existents, PIF7 és el més important en la promoció de l’allargament de l’hipocòtil en ombra. Es desconeix si la unió de PIF7 a l’ADN i al phyB modula independentment diferents aspectes del desenvolupament regulat per la llum, com passa amb PIF3, el membre fundador i probablement millor estudiat dels PIFs. Per abordar aquesta qüestió, hem portat a terme anàlisis d’estructura-funció generant derivats de PIF7 amb els dominis bHLH i APB mutats. En el primer capítol d’aquest treball, vam mostrar que les activitats de PIF7, tant d’unió a l’ADN com al phyB, estan vinculades i són fonamentals per induir ràpidament l’expressió de gens diana de PIF7 i el creixement de l’hipocòtil en ombra.

Altres components classificats com a reguladors positius i negatius participen en la modulació de la SAS mitjançant la construcció d’una xarxa reguladora complexa. No està clar, però, com s’organitzen aquests components. Per aprofundir en l’arquitectura d’aquesta xarxa de senyalització i en les connexions entre els seus components, en el segon capítol d’aquesta tesi vam realitzar anàlisis fisiològics, cel·lulars i transcriptòmics de l’allargament de l’hipocòtil induït per l’ombra utilitzant mutants deficients en els diferents reguladors. Els nostres resultats demostren que els components reguladors de la SAS s’organitzen en dues branques principals que actuen en moments lleugerament diferents del desenvolupament de la plàntula i modulen l’allargament de diferents cèl·lules al llarg de l’eix de l’hipocòtil. A més, també trobem una convergència dels senyals de les dues branques, ja que els PIFs i ELONGATED HYPOCOTYL 5 (HY5), components que pertanyen a aquestes branques separades, regulen l’expressió de gens diana comuns.

La luz es esencial para las plantas, no solo como fuente de energía para la fotosíntesis, sino también como una señal de información ambiental que les permite adaptar su desarrollo para prosperar en diferentes escenarios. En las plantas que evitan la sombra, como Arabidopsis thaliana, la proximidad de vegetación potencialmente competidora desencadena un grupo de respuestas conocido como síndrome de huida de la sombra (SAS, de sus siglas en inglés), que incluye el alargamiento del hipocótilo. Los fitocromos, que son los fotorreceptores que detectan las señales de proximidad vegetal, interaccionan con los factores de transcripción PHYTOCHROME INTERACTING FACTORs (PIFs). Esta interacción resulta en la integración de las señales de luz para ajustar el desarrollo de las plantas a estos cambios ambientales. La hipótesis actual establece que la inactivación inducida por la sombra del fitocromo B (phyB) libera la represión impuesta sobre los PIFs, lo que resulta en cambios rápidos en la expresión génica y la promoción del alargamiento del hipocótilo.

Los PIFs contienen un motivo de unión a phyB activo (APB) y un dominio básico-hélice-bucle-hélice (bHLH), responsable de la unión al ADN. Entre los PIFs existentes, PIF7 es el más importante en la promoción del alargamiento del hipocótilo en sombra. Se desconoce si la unión de PIF7 al ADN y al phyB modula independientemente diferentes aspectos del desarrollo regulado por la luz, como ocurre con PIF3, el miembro fundador y probablemente mejor estudiado de los PIFs. Para abordar esta cuestión, llevamos a cabo análisis de estructura-función generando derivados de PIF7 con los dominios bHLH y APB mutados. En el primer capítulo de este trabajo, mostramos que las actividades de PIF7, tanto de unión al ADN como al phyB están vinculadas y son fundamentales para inducir rápidamente la expresión de genes diana de PIF7 y el crecimiento del hipocótilo en sombra.

Otros componentes clasificados como reguladores positivos y negativos participan en la modulación de SAS mediante la construcción de una compleja red reguladora. Sin embargo, no está claro cómo se organizan estos componentes. Para profundizar en la arquitectura de esta red de señalización y en las conexiones entre sus componentes, en el segundo capítulo de esta tesis realizamos análisis fisiológicos, celulares y transcriptómicos del alargamiento del hipocótilo inducido por la sombra utilizando mutantes deficientes en los diferentes reguladores. Nuestros resultados demuestran que los componentes reguladores del SAS se organizan en dos ramas principales que actúan en momentos ligeramente diferentes del desarrollo de la plántula y modulan el alargamiento de diferentes células a lo largo del eje del hipocótilo. Además, también encontramos una convergencia de las señales de las dos ramas, ya que los PIFs y ELONGATED HYPOCOTYL 5 (HY5), componentes que pertenecen a estas ramas separadas, regulan la expresión de genes diana comunes.

Light is essential for plants, not only for fueling photosynthesis, but also as environmental information that allows them to adapt their development to thrive in different scenarios. In shade-avoider (sun-loving) plants, such as Arabidopsis thaliana, proximity of potentially competing vegetation triggers a group of responses known as Shade Avoidance Syndrome (SAS), including the well-studied hypocotyl elongation. Phytochromes are the photoreceptors that detect vegetation proximity signals that, by binding to PHYTOCHROME INTERACTING FACTORs (PIFs), integrate light signals into acclimation changes in plant development. The current regulatory model states that the shade-induced inactivation of phytochrome B (phyB) releases the repression imposed over PIFs, which results in the rapid activation of gene expression changes and in hypocotyl elongation promotion.

PIFs contain an active phyB-binding (APB) motif and a basic helix-loop-helix (bHLH) domain, responsible of DNA-binding. Among PIFs, the photostable PIF7 has a major role in promoting hypocotyl elongation in shade. However, it is unknown if PIF7 DNA- and phyB-binding activities can modulate independently different aspects of the light-regulated development, as it occurs in the well-studied and founder member PIF3. To address this question, we carried out a structure-function analysis by generating PIF7 derivatives with the bHLH and the APB domains mutated. In the first chapter of this work we show that both the PIF7 DNA- and phyB-binding activities are linked and fundamental to rapidly induce the expression of PIF7 targets and the hypocotyl growth in shade.

Other components classified as positive and negative regulators participate in the modulation of SAS by building a complex regulatory network. Nevertheless, it is still unclear how these components are organized. To refine the architecture of this signaling network and establish the connections between its components, in the second chapter of this thesis we carried out physiological, cell biology and transcriptomic analyses of the shade-induced hypocotyl elongation using defective mutants of the different regulators. Our results demonstrate that the SAS regulatory components are organized in two main branches that act in slightly different moments and modulate the elongation of different cells along the hypocotyl axis. Nevertheless, we also found a signaling convergence between the two branches, as PIFs and ELONGATED HYPOCOTYL 5 (HY5), components that belong to these separate branches, regulate the expression of common target genes.