Advances in post-thawing protocol of cryopreserved endangered Catalonian breed (Cabra Blanca de Rasquera) sperm doses towards improving their post-thawed fertility potential

Abstract

La Cabra Blanca de Rasquera és una raça autòctona catalana en perill d’extinció de la zona sud de Catalunya. Per a mantenir la seva existència, l’Organització de les Nacions Unides per a l’Alimentació i la Agricultura (FAO) recomana per a la conservació de les races catalogades en risc d’extinció establir programes de conservació tant in situ com ex situ (FAO, 2010). Els programes de conservació ex situ com és la crioconservació espermàtica i la creació de bancs de germoplasma permeten l’emmagatzematge del semen indefinidament a través de varis processos com la recollida de semen i la seva congelació per a la seva posterior utilització en les diferents Tecnologies de Reproducció Assistida (ART), les quals són de gran importància en la conservació de la diversitat genètica en aquestes races. No obstant, millorar la qualitat dels espermatozoides descongelats en aquesta espècie és encara una gran preocupació. Diferents estratègies tecnològiques han estat proposades per assolir una millor qualitat seminal després de la descongelació, utilitzant varies tècniques com l’anàlisi informatitzat de la motilitat espermàtica (Computer Assisted Sperm Analysis, CASA), assajos sobre l’estructura de la cromatina espermàtica (Sperm Chromatin Structural Assay, SCSA), així com altres anàlisis realitzats a través de la utilització del citòmetre de flux per a valorar les distintes característiques espermàtiques. Per tant, la principal meta d’aquesta tesi doctoral ha estat establir nous enfocs en els protocols post-descongelació de les dosis espermàtiques crioconservades del banc de la raça autòctona Cabra Blanca de Rasquera en perill d’extinció amb l’objectiu de millorar la seva viabilitat i fertilitat després de la descongelació. En la present tesi, s’ha avaluat l’efecte de la tècnica de centrifugació en capa única (Single Layer Centrifugation, SLC) usant la solució de col·loide comercial Bovipure®, sobre la qualitat espermàtica després la descongelació en relació a varis factors com la edat del donant, l’estació de la recollida del semen i l’administració d’implants de melatonina en els mascles en la època no reproductiva. L’objectiu va ser determinar si la centrifugació a través del col·loide Bovipure® pot seleccionar espermatozoides viables amb bones habilitats cinètiques, ADN intacte, mitocòndries actives i integritat de membranes plasmàtica i acrosomal, dels espermatozoides de mala qualitat, morts o moribunds després de la descongelació amb la finalitat de mimetitzar el mateix procés observat en la selecció natural que passa en el tracte reproductor femení. Per això, en aquest estudi, es recolliren 2 ejaculats/mascle/dia (n = 6 dies) via vagina artificial de 6-8 mascles durant 2 anys consecutius en el període reproductiu i no reproductiu a l’edat de 12 i 24 mesos a la tardor i de 18 y 30 mesos d’edat en primavera. Prèvia a la recollida de semen en el període no reproductiu, els mascles van ser repartits al atzar en 2 grups (4 mascles/grup): a un grup se’ls administrà implants subcutanis de melatonina mentre que a l’altre grup romandrà sense tractar. Després des descongelar, els resultats de viabilitat espermàtica total i el percentatge d’espermatozoides amb acrosoma intacte i mitocòndries actives mostraren valors significativament superiors en les mostres recollides a la tardor comparat amb les mostres de primavera. No obstant, aquestes diferències no es van reflectir després de realitzar la tècnica SLC. Respecte a la integritat de l’ADN, no es varen observar diferències significatives post-descongelació, encara que la proporció d’espermatozoides amb HDS (Alta estabilitat de l’ADN) fou superior en les mostres seminals recollides durant la tardor. Referent als paràmetres cinètics, la motilitat progressiva fou significativament superior també durant la tardor comparat amb les mostres recollides en primavera una vegada descongelades. No obstant, aquestes diferències desaparegueren després de portar a terme la centrifugació (SLC) de les distintes mostres. Finalment, no s’observaren grans diferències significatives entre les mostres seminals no seleccionades i les que foren sotmeses a la tècnica SLC respecte a la motilitat total i progressiva, viabilitat, activitat mitocondrial y la integritat acrosomal i de l’ADN, el que demostra que la centrifugació simple a través del col·loide Bovipure® dels espermatozoides descongelats no millora la seva qualitat, independientement de l’edat del mascle, l’estació durant la que se realitzà la recollida del semen o l’administració de implants de melatonina als mascles. A més, aquest treball ha avaluat l’efecte d’incubar les distintes mostres seminals descongelades sota condicions capacitants durant 3 hores per a intentar simular la supervivència dels espermatozoides descongelats durant la migració activa en el tracte reproductor femení, en relació a la edat del donant, estació de l’any de la recollida del semen o l’aplicació d’implants de melatonina en l’època no reproductiva. Per altra banda, el paper del plasma seminal ha estat extensament estudiat per diferents grups, el qual proporciona una font de nutrients per als espermatozoides, millora la motilitat espermàtica i prevé l’activació prematura de l’espermatozoide durant la seva migració pel tracte femení. Pel que l’adició de plasma seminal als espermatozoides descongelats podria ser implementada com una alternativa per a millorar la qualitat seminal. Així, en la present tesi, també s’ha avaluat l’adició d’un 20% de plasma seminal en el medi durant la incubació de 3h sota condicions capacitants amb la finalitat de millorar la qualitat espermàtica post-descongelació. No obstant, els resultats obtinguts mostraren una significativa reducció de la motilitat i viabilitat espermàtica i l’activitat mitocondrial, així com també de la integritat de l’acrosoma després 3 h d’incubació sota condiciones in vitro de capacitació, independentment de la presencia de plasma seminal en el medi, mentre que la integritat de l’ADN no es va veure afectada. Aquests resultats semblen indicar que l’adició de plasma seminal no és útil com estratègia per a millorar la qualitat dels espermatozoides descongelats de boc, independentment dels factors estudiats anteriorment citats. Així mateix, l’efecte del factor individual del donant sobre la qualitat seminal post-descongelació i sobre l’eficàcia de la tècnica de selecció SLC fou avaluat, ja que la habilitat de l’espermatozoide a sobreviure en el tracte genital femení pot variar en funció del mascle. Amb aquest objectiu, es recolliren a principis de l’hivern 2 ejaculats/mascle/dia (n = 6 dies) via vagina artificial de 6 mascles de la raça Cabra Blanca de Rasquera de aproximadament 2 anys d’edat. Després de realitzar els diferents anàlisis, poques diferències significatives foren observades després de la descongelació de les dosis individuals en la viabilitat espermàtica, activitat mitocondrial i integritat acrosomal entre els diferents mascles, mentre que, respecte a la integritat de l’ADN, motilitat total i progressiva, cap diferencia fou detectada entre donants. A més, després de realitzar la tècnica de la SLC, poques diferències individuals relacionades amb l’efectivitat d’aquest mètode foren observades, únicament 2 mascles dels 6 testats mostraren una reducció en el dany acrosomal de les dosis, mentre que en la resta de paràmetres seminals analitzats no se observaren diferències significatives entre individus després SLC. Finalment, les possibles variacions entre mascles poden també produir diferències en la congelabilitat del semen amb respecte a la seva supervivència en el tracte reproductiu femení. Alguns ejaculats poden contenir subpoblacions d’espermatozoides que difereixin en la seva capacitat fecundant i amb característiques peculiars a cada mascle (Gomes et al., 2020). Per aquest motiu, el darrer estudi de la present tesi se centrà en l’avaluació del factor individual-mascle sobre la qualitat espermàtica post-descongelació després de 3 hores d’incubació sota condicions in vitro de capacitació amb l’objectiu de determinar si la variabilitat individual pot veure’s reflectida en la seva resposta a aquestes condicions en presencia o no de plasma seminal, intentant simular la supervivència en condicions in vivo. Els resultats indicaren molt poques diferències individuals en la motilitat, viabilitat, integritat acrosomal i funció mitocondrial darrera la incubació i que la presencia de plasma seminal va reduir significativament aquests paràmetres en tots els mascles, mentre que respecte a la integritat de l’ADN, diferències individuals foren menys evidents després de 3 hores d’incubació en els diferents medis, sent inexistents en presencia de plasma seminal. Així, a partir dels resultats obtinguts en la present tesi, podem concloure que les dosis seminals descongelades de la raça Blanca de Rasquera a partir d’ejaculats obtinguts a la tardor presenten millors qualitats que les obtingudes en primavera o hivern. A pesar d’això, altres factors com l’edat del donant o l’aplicació d’implants de melatonina durant l’estació no reproductiva no milloraren la qualitat seminal post-descongelació, així com tampoc el fet de sotmetre les mostres descongelades a un suposat procés de selecció espermàtica mitjançant la tècnica de SLC a través del col·loide Bovipure®. Aquesta absència de millora de la qualitat dels espermatozoides descongelats suggereix que aquesta tècnica de selecció espermàtica no és útil per a la seva aplicació en tecnologies de reproducció assistida en aquesta raça. Per últim, l’adició de plasma seminal en el medi durant la incubació de las dosis descongelades en condicions in vitro de capacitació tampoc millorà la qualitat espermàtica, pel que no sembla ser una alternativa efectiva para ser usada amb l’objectiu d’incrementar la viabilitat i fertilitat de les dosis crioconservades del banc de semen de la raça Cabra Blanca de Rasquera en programes d’inseminació artificial o en altres tecnologies de reproducció assistida.

La Cabra Blanca de Rasquera es una raza autóctona catalana en peligro de extinción de la zona sur de Cataluña. Para mantener su existencia, la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) recomienda para la conservación de las razas catalogadas en riesgo de extinción establecer programas de conservación tanto in situ como and ex situ (FAO, 2010). Los programas de conservación ex situ como es la crioconservación espermática y la creación de bancos de germoplasma permiten el almacenamiento del semen indefinidamente a través de varios procesos como la recogida de semen y su congelación para su posterior utilización en las diferentes Tecnologías de Reproducción Asistida (ART), las cuales son de gran importancia en la conservación de la diversidad genética en estas razas. Sin embargo, mejorar la calidad de los espermatozoides descongelados en esta especie es todavía una gran preocupación. Diferentes estrategias tecnológicas han sido propuestos para lograr una mejor calidad seminal tras la descongelación, usando varias técnicas como el análisis informatizado de la motilidad espermática (Computer Assisted Sperm Analysis, CASA), ensayos sobre la estructura de la cromatina espermática (Sperm Chromatin Structural Assay, SCSA), así como otros análisis realizados a través de la utilización del citómetro de flujo para valorar las distintas características espermáticas. Por lo tanto, la principal meta de esta tesis doctoral ha sido establecer nuevos enfoques en los protocolos tras descongelación de las dosis espermáticas crioconservadas del banco de la raza autóctona Cabra Blanca de Rasquera en peligro de extinción con el objetivo de mejorar su viabilidad y fertilidad tras la descongelación. En la presente tesis, se ha evaluado el efecto de la técnica de centrifugación en capa única (Single Layer Centrifugation, SLC) usando la solución de coloide comercial Bovipure®, sobre la calidad espermática tras la descongelación en relación a varios factores como la edad del donante, la estación de la recogida del semen y la administración de implantes de melatonina en los machos en la época no reproductiva. El objetivo fue determinar si la centrifugación a través del coloide Bovipure® puede seleccionar espermatozoides viables con buenas habilidades cinéticas, ADN intacto, mitocondrias activas e integridad de membranas plasmática y acrosomal, de los espermatozoides de mala calidad, muertos o moribundos tras la descongelación con la finalidad de mimetizar el mismo proceso observado en la selección natural que ocurre en el tracto reproductor femenino. Para ello, en este estudio, se recogieron 2 eyaculados/macho/día (n = 6 días) vía vagina artificial de 6-8 machos durante 2 años consecutivos en el periodo reproductivo y no reproductivo a la edad de 12 y 24 meses en otoño y de 18 y 30 meses de edad en primavera. Previa a la recogida de semen en el periodo no reproductivo, los machos fueron repartidos al azar en 2 grupos (4 machos/grupo): a un grupo se les administró implantes subcutáneos de melatonina mientras que el otro grupo permaneció sin tratar. Tras descongelar, los resultados de viabilidad espermática total y el porcentaje de espermatozoides con acrosoma intacto y mitocondrias activas mostraron valores significativamente superiores en las muestras recogidas en otoño comparado con las muestras de primavera. Sin embargo, estas diferencias no se reflejaron tras realizar la técnica SLC. Respecto a la integridad del ADN, no se observaron diferencias significativas tras la descongelación, aunque la proporción de espermatozoides con HDS (Alta estabilidad del ADN) fue superior en las muestras seminales recogidas durante otoño. Referente a los parámetros cinéticos, la motilidad progresiva fue significativamente superior también durante otoño comparado con las muestras recogidas en primavera una vez descongeladas. No obstante, estas diferencias desaparecieron tras llevar a cabo la centrifugación (SLC) de las distintas muestras. Finalmente, no se observaron grandes diferencias significativas entre las muestras seminales no seleccionadas y las que fueron sometidas a la técnica SLC respecto a la motilidad total y progresiva, viabilidad, actividad mitocondrial el integridad acrosomal y de ADN, lo que demuestra que la centrifugación simple a través del coloide Bovipure® de los espermatozoides descongelados no mejoró su calidad, independientemente de la edad del macho, la estación durante la que se realizó la recogida del semen o la administración de implantes de melatonina a los machos. Además, este trabajo ha evaluado el efecto de incubar las distintas muestras seminales descongeladas bajo condiciones capacitantes durante 3 horas para intentar simular la supervivencia de los espermatozoides descongelados durante la migración activa en el tracto reproductor femenino, en relación a la edad del donante, estación del año de la recogida del semen o la aplicación de implantes de melatonina en la época no reproductiva. Por otra parte, el papel del plasma seminal ha sido extensamente estudiado por diferentes grupos, el cual proporciona una fuente de nutrientes para los espermatozoides, mejora la motilidad espermática y previene la activación prematura del espermatozoide durante su migración por el tracto femenino (Desnoyers & Manjunath, 1992; Rozeboom et al., 2000a). Por lo que la adición de plasma seminal a los espermatozoides descongelados podría ser implementada como una alternativa para mejorar la calidad seminal (Maxwell et al., 2007). Así, en la presente tesis, también se ha evaluado la adición de un 20% de plasma seminal en el medio durante la incubación de 3h bajo condiciones capacitantes con la finalidad de mejorar la calidad espermática tras la descongelación. Sin embargo, los resultados obtenidos mostraron una significativa reducción de la motilidad y viabilidad espermática y la actividad mitocondrial, así como también de la integridad del acrosoma tras 3 h de incubación bajo condiciones in vitro de capacitación, independientemente de la presencia de plasma seminal en el medio, mientras que la integridad del ADN no se vio afectada. Estos resultados parecen indicar que la adición de plasma seminal no es útil como estrategia para mejorar la calidad de los espermatozoides descongelados de macho cabrío, independientemente de los factores estudiados anteriormente citados. Asimismo, el efecto del factor individual del donante sobre la calidad seminal post-descongelación y sobre la eficacia de la técnica de selección SLC fue evaluado, ya que la habilidad del espermatozoide a sobrevivir en el tracto genital femenino puede variar en función del macho. Con este objetivo, se recogieron a principios de invierno 2 eyaculados/macho/día (n = 6 días) vía vagina artificial de 6 machos de la raza Cabra Blanca de Rasquera de aproximadamente 2 años de edad. Tras llevar a cabo los diferentes análisis, pocas diferencias significativas fueron observadas tras la descongelación de las dosis individuales en la viabilidad espermática, actividad mitocondrial e integridad acrosomal entre los distintos machos, mientras que, respecto a la integridad del ADN, motilidad total y progresiva, ninguna diferencia fue detectada entre donantes. Además, tras realizar la técnica de la SLC, pocas diferencias individuales relacionadas con la efectividad de este método fueron observadas, únicamente 2 machos de los 6 testados mostraron una reducción en el daño acrosomal de las dosis, mientras que en el resto de parámetros seminales analizados no se observaron diferencias significativas entre individuos tras SLC. Finalmente, las posibles variaciones entre machos pueden también producir diferencias en la congelabilidad del semen con respecto a su supervivencia en el tracto reproductivo femenino (Shannon, 1978). Algunos eyaculados pueden contener subpoblaciones de espermatozoides que difieran en su capacidad fecundante y cuyas características son peculiares a cada macho (Gomes et al., 2020). Por este motivo, el último estudio de la presente tesis se centró en la evaluación del factor individual-macho sobre la calidad espermática post-descongelación tras 3 horas de incubación bajo condiciones in vitro de capacitación con el objetivo de determinar si la variabilidad individual puede verse reflejada en su respuesta a estas condiciones en presencia o no de plasma seminal, intentando simular la supervivencia en condiciones in vivo. Los resultados indicaron escasas diferencias individuales en la motilidad, viabilidad, integridad acrosomal y función mitocondrial tras la incubación y que la presencia de plasma seminal redujo significativamente estos parámetros en todos los machos, mientras que respecto a la integridad del ADN, diferencias individuales fueron menos evidentes tras 3 horas de incubación en los diferentes medios, siendo inexistentes en presencia de plasma seminal. Así, a partir de los resultados obtenidos en la presente tesis, podemos concluir que las dosis seminales descongeladas de la raza Blanca de Rasquera a partir de eyaculados obtenidos en otoño presentan mejores cualidades que las obtenidas en primavera o invierno. A pesar de ello, otros factores como la edad del donante o la aplicación de implantes de melatonina durante la estación no reproductiva no mejoraron la calidad seminal post-descongelación, así como tampoco el hecho de someter las muestras descongeladas a un supuesto proceso de selección espermática mediante la técnica de SLC a través del coloide Bovipure®. Esta ausencia de mejora de la calidad de los espermatozoides descongelados sugiere que esta técnica de selección espermática no es útil para su aplicación en tecnologías de reproducción asistida en esta raza. Por último, la adición de plasma seminal en el medio durante la incubación de las dosis descongeladas en condiciones in vitro de capacitación tampoco mejoró la calidad espermática, por lo que no parece ser una alternativa efectiva para ser usada con el objetivo de incrementar la viabilidad y fertilidad de las dosis crioconservadas del banco de semen de la raza Cabra Blanca de Rasquera en programas de inseminación artificial o en otras tecnologías de reproducción asistida.

The Cabra Blanca de Rasquera is a native Catalonian breed of goats from the southern region of Catalonia enlisted as an endangered breed at the verge of extinction. To maintain the existence of this breed, the Food and Agricultural Organization of the United Nation (FAO) endorsed the preservation of breeds in danger of extinction by establishing in situ and ex situ conservation programmes (FAO, 2010). Ex situ programmes such as semen cryopreservation and the development of a genetic sperm bank enables the storage of semen indefinitely through various processes such as semen collection, processing, and freezing. Furthermore, the utilization of this process towards Assisted Reproductive Technologies (ART) is of major importance in preserving the genetic diversity of this breed. However, improving the post thaw sperm quality of this species is still a major concern. Several technological strategies have been proposed in order to achieve a better post thaw sperm quality, using various techniques such as the computer assisted sperm analysis (CASA), Sperm Chromatin Structural Assay (SCSA) and other different analyses through flow cytometer to assess sperm quality. Therefore, the major goal of this doctoral thesis was to establish new approaches in the protocols after thawing of cryopreserved sperm bank doses of this local breed, Cabra Blanca de Rasquera in danger of extinction with the aim of improving their post thaw viability and fertility. In this thesis, we evaluated the effect of Single Layer Centrifugation (SLC) technique using Bovipure® colloid on the quality of sperm after thawing in relation to various factors such as donor age, season of collection and the effect of melatonin implant on the males during the non-breeding season. The aim was to determine if centrifugation through Bovipure® colloid can select viable spermatozoa of good motile abilities, active mitochondria, intact DNA and membrane integrity from bad and moribund ones after thawing in order to mimic the same process seen during natural selection in the female reproductive tract. In this study, two ejaculates/male/day were collected (n = 6 days) via artificial vagina from 6-8 males during 2 consecutive years in the breeding and non-breeding periods, at 12 and 24 months old in autumn and at 18 and 30 months old in spring. Prior to semen collection in the non-breeding period, males were randomly divided into two groups: one group was implanted with melatonin, while the other was not. After thawing, results for the total viability, sperm with intact acrosome and active mitochondria showed significantly higher values in samples collected in autumn compared to those collected during spring regardless of melatonin implant. However, these differences were not reflected after SLC. Regarding the DNA integrity, there were no major significant differences found after thawing and after SLC. However, after SLC, the High DNA Stainability (HDS) showed significantly higher values during autumn compared to those in spring with or without melatonin implant. In regards to the motion parameters, the progressive motility (PM) after thawing showed significantly higher values during autumn compared to samples collected during spring regardless of melatonin implant. Nonetheless, these significant values were not reflected after SLC. In relation to the distribution of the motile sperm subpopulation, no major significant differences were observed after thawing in relation to age, season, and melatonin treatment except the SP3 sperm (characterised by sperm with high velocities and low linearity) which were slightly higher in autumn compared to implanted males in spring. Also, after SLC, no significant improvements were observed in the sperm motile subpopulation distribution. This study demonstrates that SLC through Bovipure® colloid after thawing did not improve cryopreserved buck sperm quality regardless of the male age, semen collection season and melatonin implant of the donors. In this thesis, the effect of incubating thawed sperm samples for 3 hours under capacitation conditions in order to mimic the survivability of thawed sperm for a period of time during active migration in the female reproductive tract, in relation to donor age, season of collection, and melatonin implants of the males in the non-breeding season was investigated. On the other hand, the role of seminal plasma has been extensively studied for different groups, and it has been found that it provides a source of nutrient to the spermatozoa, improves sperm motility, prevents premature activation during migration of spermatozoa in the female reproductive tract (Desnoyers & Manjunath, 1992; Rozeboom et al., 2000a). Therefore, the addition of seminal plasma to frozen-thawed sperm could be implemented as an alternative to improving sperm quality (Maxwell et al., 2007). In the present thesis, the addition of 20% seminal plasma (SP) in the incubation media for 3h under in vitro capacitation conditions in order to improve sperm quality after thawing was evaluated. Our results showed that a significant reduction on motility, viability, mitochondria activity and acrosome integrity were observed after 3 h incubation under in vitro capacitation conditions, regardless of the addition of SP in the media. Similarly, the addition of SP did not improve the distribution of the sperm motile subpopulation. While there was no effect on the DNA integrity. Therefore, the addition of SP failed to improve post thaw buck sperm quality irrespective of male age, season of collection and melatonin implant. Furthermore, the assessment of individual male factor on post-thawed buck sperm quality and on the effectiveness of SLC was carried out, since the ability of spermatozoa to survive in the female reproductive tract may vary according to different individual males. To this regard, semen was collected via artificial vagina from 6 male goats of the Cabra Blanca de Rasquera breed, approximately 2 years of age in early winter. After carrying out various analyses, few significant differences were observed immediately after thawing on total sperm viability, mitochondria activity and acrosome membrane integrity between individual males, while in regards to the DNA integrity, total and progressive motility, no significant differences were observed between donors after thawing. Similarly, in relation to the motile sperm subpopulation distribution, no significant differences were found. Furthermore, after SLC, only few individual differences related to the effectiveness of SLC were observed, where 2 males from the 6 tested males showed significantly reduced acrosome damage. In regards to the other sperm analysed parameters, no significant effect of SLC was observed between males. Lastly, the variations that exist between males can also influence differences in the male freezabilities with respect to their survival in the female reproductive tract (Shannon, 1978). Some ejaculates may contain subpopulations of spermatozoa that vary in fertilizing capacity, and these characteristics are peculiar to each male (Gomes et al., 2020). Therefore, the last study was the assessment of individual male factor on post-thawed buck sperm quality after 3 h incubation under capacitation conditions with the aim to determine if individual male variability may be reflected on their response to in-vitro incubation under capacitation conditions with or without the presence of seminal plasma thus mimicking the survivability during migration in the female reproductive tract. We found that few individual differences were observed in the motility, viability, acrosome membrane integrity, and mitochondria function. Also few differences were observed in the sperm motile subpopulation distribution after 3hours incubation and the presence of seminal plasma significantly reduced these parameters in all the males without improving the overall quality of these parameters. However, in regards to the DNA integrity, individual differences were less manifested after 3h incubation in the different media, which were inexistent in the presence of SP. From the results obtained in this study, we can conclude that the frozen-thawed seminal doses from Cabra Blanca de Rasquera semen bank collected during autumn showed better qualities than the thawed sperm doses obtained during spring or winter. Notwithstanding, other factors such as donor age and melatonin implant during the non-breeding season did not improve thawed sperm quality. Also Single layer centrifugation procedure through Bovipure® colloid did not improve the quality of thawed sperm samples from this breed and as such may not be useful in selecting spermatozoa of good quality after thawing towards its use for assisted reproductive technologies. Finally, the addition of seminal plasma after thawing, or during in-vitro incubation did not improve the overall quality of spermatozoa. Therefore, it does not seem to be an effective alternative to be used with the aim of improving the viability and fertility of frozen sperm doses from Cabra Blanca de Rasquera semen bank in artificial insemination programmes or towards its use for other assisted reproductive techniques.