Development of new immunostimulant and antimicrobial protein-based molecules from a One Health perspective

Abstract

El descobriment dels antibiòtics és considerat una de les principals fites de la medicina moderna. No obstant això, l’abús i l’ús excessiu d’antibiòtics ha desencadenat una ràpida expansió de la resistència antimicrobiana (AMR), comprometent tant la salut humana com l’animal. En aquest escenari, l’Organització Mundial de la Salut va demanar que s’abordés la crisis de AMR mitjançant una estratègia multifacética, transdisciplinària i integradora, anomenada One Health Approach. El desenvolupament de tractaments alternatius als antibiòtics és un aspecte crític en la lluita contra la resistència antimicrobiana. Dins d’aquest marc, els pèptids de defensa de l’hoste (HDPs) presenten una dualitat destacada com antimicrobians d’ampli espectre -fins i tot contra els bacteris AMR-, i molècules de regulació immunitària de l’hoste, despertant l’interès de la comunitat científica. Tot i així, generalment els HDPs es sintetitzen químicament, provocant un alt cost associat que implica un gran inconvenient per la seva implementació a gran escala. En aquest context, la producció de proteïnes recombinats emergeix com una alternativa assequible per compostos antimicrobians basats en proteïnes amb uns rendiments notables i fàcil escalat. No obstant, la producció recombinant de HDPs és complexa degut a les seves característiques intrínseques, on la seva reduïda mida condiciona una primerenca degradació proteolítica en l’hoste bacterià recombinant, juntament amb una toxicitat no desitjada, esdevenen en conjunt els principals obstacles per la seva producció recombinant. Per tant, amb l’objectiu de trobar el potencial dels HDPs com a els agents antimicrobians de pròxima generació, aquesta tesi s’ha focalitzat en el desenvolupament de medicaments antimicrobians modificables basats en HDPs utilitzant i millorant l’aproximació de la seva producció recombinant. Com a primer pas, hem explorat quines fàbriques cel·lulars microbianes són més adients per la seva producció, sempre tenint en compte la presència de ponts de disulfur conservats en les defensines, una de les famílies més rellevants dels HDPs. A més, per fer front als problemes relacionats amb la proteòlisis i potencial toxicitat envers el productor bacterià, hem desenvolupat una primera generació de pèptids antimicrobians en els quals els HDPs s’han fusionat amb la Green Fluorescence Protein (GFP). Addicionalment, també hem considerat fonts alternatives per purificar els HDPs tenint en compte la seva alta ratio d’agregació i formació de cossos d’inclusió (IBs). Els nostres primers resultats van indicar que Escherichia coli BL21 és un bon hoste per la seva producció, aconseguint molècules antimicrobianes amb gran activitat i puresa. També hem demostrat que IBs són una font natural de HDPs d’alta qualitat, desenvolupant específicament un protocol no desnaturalitzant lliure de detergents per evitar pèrdues d’activitat inesperades. Aquests resultats ens han encoratjat a construir una segona generació de proteïnes antimicrobianes basades en HDPs, combinant els HDPs més prometedors en un sol polipèptid i eliminant la GFP. En general, vam provar com aquestes construccions multidomini tenen un activitat antimicrobiana millorada d’ampli aspecte i una MIC més baixa que els seus anàlegs monodomini, demostrant l’efecte sinèrgic de combinar diferents HDPs. Al mateix temps, també hem abordat la problemàtica de AMR mitjançant un enfocament complementari, basat en el desenvolupament de nous IBs formats per citocines amb capacitat immunoestimulants produït en Lactococcus lactis. La nostra hipòtesis era augmentar la resiliència de l’animal a les infeccions mitjançant l’activació del seu sistema immunitari de forma prèvia a un moment de producció crític, reduint la necessitat de tractaments amb antibiòtic. Interessantment, les primeres troballes in vitro van demostrar les propietats immunoestimulants de les citocines nanoparticulades de porcí, encara que només és va observar una tendència en els experiments preliminars in vivo amb garrins.

El descubrimiento de los antibióticos es considerado uno de los principales hitos de la medicina moderna. Sin embargo, el abuso y el uso excesivo de antibióticos ha desencadenado una rápida expansión de la resistencia antimicrobiana (AMR), comprometiendo tanto la salud humana como la de los animales. En este escenario, la Organización Mundial de la Salud pidió que se abordara la crisis de AMR mediante una estrategia multifacética, transdisciplinaria e integradora, denominada One Health Approach. El desarrollo de tratamientos alternativos a los antibióticos es un aspecto crítico en la lucha contra la resistencia antimicrobiana. Dentro de esta conjetura, los péptidos de defensa del huésped (HDPs) presentan una dualidad notoria como antimicrobianos de amplio espectro -incluso contra las bacterias AMR-, y moléculas de regulación inmunitaria del huésped, despertando el interés de la comunidad científica. Aun así, generalmente los HDPs se sintetizan químicamente, provocando un alto coste asociado, que implica un gran inconveniente en su implementación a gran escala. En este contexto, la producción de proteínas recombinantes emerge como una alternativa asequible para compuestos antimicrobianos basados en proteínas con unos rendimientos notables y fácil cambio de escala. No obstante, la producción recombinante de los HDPs es compleja debido a sus características intrínsecas, donde su reducido tamaño condiciona una temprana degradación proteolítica en el huésped bacteriano recombinante, junto con una toxicidad no deseada, acontecen en conjunto los principales obstáculos para su producción recombinante. Por lo tanto, con el objetivo de desenmascarar el potencial de los HDPs como agentes antimicrobianos de vanguardia, esta tesis se ha focalizado en el desarrollo de medicamentos antimicrobianos modificables basados en HDPs utilizando y mejorando la aproximación de su producción recombinante. Como primer paso, hemos explorado qué fábricas celulares microbianas son más adecuadas para su producción, siempre teniendo en cuenta la presencia de puentes de disulfuro conservados en las defensinas, una de las familias más relevantes de los HDPs. Además, para hacer frente a los problemas relacionados con la proteólisis y potencial toxicidad hacia el huésped bacteriano, hemos desarrollado una primera generación de péptidos antimicrobianos en los cuales los HDPs se han fusionado con la Green Fluorescence Protein (GFP). Adicionalmente, también hemos considerado fuentes alternativas para purificar los HDPs teniendo en cuenta su alto ratio de agregación y formación de cuerpos de inclusión (IBs). Nuestros primeros resultados indicaron que Escherichia coli BL21 es un buen huésped para su producción, consiguiendo moléculas antimicrobianas con gran actividad y pureza. También hemos demostrado que IBs son una fuente natural de HDPs de alta calidad, desarrollando específicamente un protocolo no desnaturalizante libre de detergentes para evitar así pérdidas de actividad inesperadas. Estos resultados nos han alentado a construir una segunda generación de proteínas antimicrobianas basadas en HDPs, combinando los HDPs más prometedores en un solo polipéptido y eliminando la GFP. En general, probamos como estas construcciones multidominio tienen una actividad antimicrobiana amplio aspecto mejorada y una MIC más baja que sus análogos monodominio, demostrando el efecto sinérgico de combinar diferentes HDPs. Al mismo tiempo, también hemos abordado la problemática de AMR mediante un enfoque complementario, basado en el desarrollo de nuevos IBs formados por citocinas con capacidad inmunoestimuladora producidas en Lactococcus lactis. Nuestra hipótesis era aumentar la resiliencia del animal a las infecciones mediante la activación de su sistema inmunitario de forma previa a un momento de producción crítico, reduciendo la necesidad de tratamientos con antibiótico. Interesantemente, los primeros hallazgos in vitro demostraron las propiedades inmunoestimuladoras de las citocinas nanoparticuladas de porcino, aunque solo es observó una tendencia en los experimentos preliminares in vivo con lechones.

Antibiotics breakthrough is considered among the most remarkable hallmarks of modern medicine. However, antibiotic misuse and overuse have triggered the swift expansion of antimicrobial resistance (AMR), compromising both human and animal health. In this scenario, the World Health Organization called for addressing the AMR crisis using a multifaceted, transdisciplinary and integrative strategy, named One Health Approach. The development of alternative treatments to antibiotics is a critical aspect in the AMR fight. Within this framework, the Host Defense Peptides (HDPs) hold an outstanding duality as broad-spectrum antimicrobials -even against AMR bacteria-, and host immune regulation molecules, arousing the scientific community interest. Still, HDPs are generally chemically synthesized, but the high associated cost entails a major drawback for broader implementation. In this context, recombinant protein production emerges as an inexpensive source of antimicrobial protein-based compounds with noteworthy yields and straightforward scale-up. Although promising, recombinant HDP production is challenging due to the HDPs characteristics, being their small size, an early proteolytic degradation in the recombinant bacterial host, coupled with non-desirable recombinant host toxicity, the major obstacles for their recombinant production. With the aim of pursuing HDPs potential as the next generation antimicrobials, this thesis has been focused on the development of tunable HDPs-based antimicrobial drugs using and improving a recombinant production approach. As a first step, we have explored the most appropriate microbial cell factory for their production, taking into account the presence of conserved disulfide bridges in defensins, one of the most relevant HDPs family. In addition, to overcome proteolytic-related issues and potential toxicity for the bacterial producer, we have developed first-generation antimicrobial peptides in which HDPs have been fused to the Green Fluorescence Protein (GFP) carrier. Besides, we have also assessed alternative sources to purify the HDPs, considering their high aggregation ratio and inclusion bodies (IBs) formation. Our first findings pointed out that Escherichia coli BL21 is a suitable host for their production, achieving highly pure and active antimicrobial molecules. We have also demonstrated that IBs are a natural source of high-quality HDPs, developing also a free-detergent non-denaturing protocol to avoid unexpected activity losses. These results have encouraged us to construct a second-generation of HDP-based antimicrobial proteins, combining the most promising HDPs in a single polypeptide and removing the GFP carrier. Overall, we showed how these multidomain constructs hold an enhanced broad-spectrum antimicrobial activity and lower minimal inhibitory concentration (MIC) than their monodomain analogs, proving the synergic effect of combining different HDPs. Concurrently, we also tackled the AMR problems by using a complementary approach based on the development of novel cytokine-based IBs immunostimulants produced in Lactococcus lactis. The hypothesis was to increase the animal resilience to infections by activation of their immune system previous to critical productive moments, which will decrease the need of using antibiotic treatments. Interestingly, the first in vitro findings demonstrated the immunostimulant properties of the nanoparticulated porcine cytokines, although only a tendency was observed in preliminary in vivo experiments with piglets.