Aplicación de los Péptidos de Penetración Celular y de la herramienta de edición génica CRISPR/Cas9 en la modelización in vivo de carcinomas uterinos

Abstract

l càncer d'endometri (CE) és el càncer ginecològic més comú als països desenvolupats i la seva incidència està augmentant a tot el món. Els factors que han contribuït a aquesta tendència són una població més envellida i la disminució de la pràctica d’histerectomies benignes. Si bé és cert que la majoria dels càncers d'endometri es curen mitjançant la histerectomia, les pacients que tenen una malaltia avançada presenten un pronòstic dolent. La necessitat del tractament del càncer d’endometri continua, avui en dia, sent un repte. També ho és la necessitat d’una comprensió més profunda de la diversitat genètica d’aquesta malaltia, així com la dels impulsors que en desenvolupen els diferents estats patogènics. Tot això ha permès el desenvolupament i l’estudi de diversos models murins per tal d'entendre les complexitats d'aquest tipus de tumor. A més, els avenços en el camp de la biologia molecular han possibilitat el desenvolupament de noves estratègies quimioterapèutiques dirigides. Pten i p53, que tenen funció supressora de tumors, són dos dels gens amb major nombre d'alteracions genètiques en CE. Així, l'objectiu principal d'aquest treball és aconseguir la supressió específica i única de la funció d’aquests gens en les cèl·lules epitelials endometrials. En aquest estudi s'han establert diversos models per al futur estudi de la implicació d'ambdues mutacions en l'inici i la progressió de tumors ginecològics, principalment del CE. Els primers models que es descriuen s'han desenvolupat mitjançant el sistema Cre/loxP, que permet la inducció temporal de l'ablació gènica amb tamoxifè utilitzant la línia Cre:ERT com a font de recombinasa. En el segon model s’ha utilitzat la recombinasa fusionada a un pèptid de penetració cel·lular (CPP), que genera l'ablació gènica in situ a les cèl·lules en les quals s'ha administrat. Finalment, hem creat un mètode per generar mutacions a demanda en cèl·lules epitelials endometrials mitjançant el sistema d'edició gènica CRISPR/Cas9, a través de l'administració in vivo de ribonulceoproteïna (RNP) a l'úter del ratolí amb la tècnica de l’electroporació. Emprant aquest tercer model no només som capaços de generar mutacions en Pten i p53, sinó que també podem generar mutacions en altres gens implicats en la carcinogènesi endometrial.

El cáncer de endometrio (CE) es el cáncer ginecológico más común en los países desarrollados y su incidencia está aumentando en todo el mundo. Los factores que han contribuido a esta tendencia son una población más envejecida y la disminución de la práctica de histerectomías benignas. Si bien es cierto que la mayoría de los cánceres de endometrio se curan mediante la histerectomía, las pacientes que padecen una enfermedad avanzada presentan un pronóstico malo. La necesidad del tratamiento del cáncer de endometrio sigue, hoy en día, siendo un reto. También lo es la necesidad de una comprensión más profunda de la diversidad genética de esta enfermedad, así como la de los impulsores que desarrollan sus diferentes estados patogénicos. Todo esto ha permitido el desarrollo y el estudio de varios modelos murinos para entender las complejidades de este tipo de tumor. Además, los avances en el campo de la biología molecular han posibilitado el desarrollo de nuevas estrategias quimioterapéuticas dirigidas. Pten y p53, que tienen función supresora de tumores, son dos de los genes con mayor número de alteraciones genéticas en CE. Así, el principal objetivo de este trabajo es conseguir la supresión específica y única de la función de estos genes en las células epiteliales endometriales. En este estudio se han establecido varios modelos para el futuro estudio de la implicación de ambas mutaciones en el inicio y progresión de tumores ginecológicos, principalmente del CE. Los primeros modelos que se describen se han desarrollado mediante el sistema Cre/loxP, que permite la inducción temporal de la ablación génica con tamoxifeno utilizando la línea Cre:ERT como fuente de recombinasa. En el segundo modelo se ha utilizado la recombinasa fusionada a un péptido de penetración celular (CPP), que genera la ablación génica in situ en las células en las que se ha administrado. Por último, hemos creado un método para generar mutaciones a demanda en células epiteliales endometriales mediante el sistema de edición génica CRISPR/Cas9, a través de la administración in vivo de ribonulceoproteína (RNP) en el útero del ratón con la técnica de la electroporación. Empleando este tercer modelo no sólo somos capaces de generar mutaciones en Pten y p53, sino que también podemos generar mutaciones en otros genes implicados en la carcinogénesis endometrial.

Endometrial cancer (EC) is the most common gynecologic cancer in developed countries and its incidence is increasing worldwide. Factors that have contributed to this trend are an aging population and the decline in the practice of benign hysterectomies. While it is true that most endometrial cancers are treated by hysterectomy, patients with advanced disease have a poor prognosis. The need for treatment of endometrial cancer remains a challenge today. So is the need for a deeper understanding of the genetic diversity of this disease, as well as that of the drivers that develop its different pathogenic states. All this has allowed the development and study of several murine models to understand the complexities of this type of tumor. In addition, advances in the field of molecular biology have enabled the development of new-targeted chemotherapeutic strategies. Pten and p53, which have tumor suppressor functions, are two of the genes with the highest number of genetic alterations in SC. Thus, the main objective of this work is to achieve specific and unique suppression of the function of these genes in endometrial epithelial cells. In this study, several models have been established for the future study of the involvement of both mutations in the initiation and progression of gynecological tumors, mainly EC. The first models described have been developed using the Cre/loxP system, which allows the temporary induction of gene ablation with tamoxifen using the Cre:ERT line as a source of recombinase. In the second model, recombinase fused to a cell penetrating peptide (CPP) has been used, which generates in situ gene ablation in the cells in which it has been administered. Finally, we have created a method to generate on-demand mutations in endometrial epithelial cells using the CRISPR/Cas9 gene editing system through in vivo administration of ribonulceoprotein (RNP) in the mouse uterus using the electroporation technique. Using this third model, we are not only able to generate mutations in Pten and p53, but we can also generate mutations in other genes involved in endometrial carcinogenesis.