Mechanistic Investigations to Enhance Carotenoid Content and Composition in Rice Endosperm

Abstract

El meu projecte de recerca es centra en les investigacions per comprendre millor el mecanisme d'acumulació de carotenoides en call i endosperma d'arròs. Un dels principals objectius és comprendre millor el coll d'ampolla de la via biosintètica dels carotenoides, analitzant els gens implicats en l'acumulació de carotenoides i la seva funcionalitat per utilitzar-los posteriorment en aplicacions d'enginyeria metabòlica. Els objectius generals eren: 1) reconstituir una via nativa de carotenoides a l'endosperma d'arròs definint el nombre mínim de gens necessaris per acumular β-carotè; 2) restaurar l'expressió d'OsPSY1 a l'endosperma mitjançant la reactivació del seu promotor; 3) provar si els gens del factor de divisió del cloroplast en combinació amb els gens carotenogènics milloren l'acumulació de carotenoides a l'endosperma d'arròs. El PSY1 fa el primer pas de la via biosintètica dels carotenoides. A l'endosperma d'arròs, el promotor de PSY1 no està actiu, per la qual cosa la primera part del meu treball ha estat definir el nombre mínim de gens necessaris per acumular β-carotè a l'endosperma d'arròs. Als primers experiments, es van transformar plantes d'arròs amb OsPSY1 i OsPDS. Els resultats van indicar que la combinació d'aquests dos gens condueix a l'acumulació de β-carotè al call d'arròs. Tanmateix, la co-transformació dels gens subsegüents (OsZDS, OsZISO i OsCRTISO) serà important per a la plena comprensió de cadascun dels gens i la funció en l'acumulació de carotenoides a l'endosperma de l'arròs. El treball futur ha de centrar-se en generar una població de plantes d'arròs transgèniques amb la combinació de tots els gens esmentats per disseccionar la funció de cada gen a la ruta metabòlica. La segona part del meu projecte es va centrar en la reactivació del promotor de l'OSPSY1 específicament a l'endosperma de l'arròs. Per assolir aquest objectiu, identifiquem sis possibles elements cis-reguladors específics de l'endosperma a la regió promotora d'OsPSY1: tres caixes p de prolamina, un motiu AACA, un motiu similar a GCN4 i una caixa opaca 2 (caixa O2). Per provar la nostra hipòtesi, construïm dos promotors sintètics de OsPSY1 amb 6 motius i 4 motius corregits per a l'expressió de GFP. La versió de tipus salvatge del promotor OsPSY1 controlant l'expressió de GFP es va utilitzar com a control negatiu. Els resultats van confirmar que GFP s'expressava en gran mesura i que la proteïna GFP s'acumulava i es detectava a les línies de tripa d'arròs transgènic que contenien el promotor OsPSY1 corregit amb 6 i 4 motius. Tot plegat, aquests resultats confirmen que el promotor corregit d'OsPSY1 va activar l'expressió del gen. Els elements reguladors cis tenen el potencial de regular OsPSY1, i quan són presents poden activar el promotor d'OsPSY1, recolzant fortament el seu paper en l'expressió d'OsPSY1 a l'endosperma de l'arròs. A més, descrivim una tercera estratègia per entendre el paper dels factors de divisió del cloroplast AtPDV1 i AtARC3 a l'acumulació de carotenoides a l'endosperma de l'arròs. Una de les nostres estratègies va ser combinar els gens de divisió del cloroplast (AtARC3 i AtPDV1) amb gens carotenogènics (ZmPSY1 i PaCRTI). Aquesta estratègia no va donar lloc a diferències significatives en l'acumulació de carotenoides i la quantitat de cromoplasts. A la segona estratègia combinem els factors de divisió de cloroplasts (AtARC3 i AtPDV1) amb AtOrHis per potenciar l'acumulació de carotenoides a l'endosperm de l'arròs. Demostrem la co-transformació de l'arròs amb els tres gens (AtARC3, AtPDV1 i AtOrHis). També confirmem l'acumulació d'ARNm per als tres gens al call d'arròs. Tot i així, estem lluny d'identificar tots els factors necessaris que controlen la divisió i el nombre de cromoplasts. Seran necessaris més experiments per identificar i caracteritzar les proteïnes que s'associen a aquests factors per tal de determinar-ne el paper precís en l'acumulació de carotenoides a l'endosperma de l'arròs.

Mi proyecto de investigación se centra en las investigaciones para comprender mejor el mecanismo de acumulación de carotenoides en callo y endospermo de arroz. Uno de los principales objetivos es comprender mejor el cuello de botella de la vía biosintética de los carotenoides, analizando los genes implicados en la acumulación de carotenoides y su funcionalidad para su posterior uso en aplicaciones de ingeniería metabólica. Los objetivos generales eran: 1) reconstituir una vía nativa de carotenoides en el endospermo de arroz definiendo el número mínimo de genes necesarios para acumular β-caroteno; 2) restaurar la expresión de OsPSY1 en el endospermo mediante la reactivación de su promotor; 3) probar si los genes del factor de división del cloroplasto en combinación con los genes carotenogénicos mejoran la acumulación de carotenoides en el endospermo de arroz. El PSY1 realiza el primer paso de la vía biosintética de los carotenoides. En el endospermo de arroz, el promotor de PSY1 no está activo, por lo que la primera parte de mi trabajo ha sido definir el número mínimo de genes necesarios para acumular β-caroteno en el endospermo de arroz. En los primeros experimentos, se transformaron plantas de arroz con OsPSY1 y OsPDS. Los resultados indicaron que la combinación de estos dos genes conduce a la acumulación de β-caroteno en el callo de arroz. Sin embargo, la co-transformación de los genes subsiguientes (OsZDS, OsZISO y OsCRTISO) será importante para la plena comprensión de cada uno de los genes y la función en la acumulación de carotenoides en el endospermo del arroz. El trabajo futuro debe centrarse en la generación de una población de plantas de arroz transgénicas con la combinación de todos los genes mencionados para diseccionar la función de cada gen en la ruta metabólica. La segunda parte de mi proyecto se centró en la reactivación del promotor del OsPSY1 específicamente en el endospermo del arroz. Para lograr este objetivo, identificamos seis posibles elementos cis-reguladores específicos del endospermo en la región promotora de OsPSY1: tres cajas p de prolamina, un motivo AACA, un motivo similar a GCN4 y una caja opaca 2 (caja O2). Para probar nuestra hipótesis, construimos dos promotores sintéticos de OsPSY1 con 6 motivos y 4 motivos corregidos para la expresión de GFP. La versión de tipo salvaje del promotor OsPSY1 controlando la expresión de GFP se utilizó como control negativo. Los resultados confirmaron que GFP se expresaba en gran medida y que la proteína GFP se acumulaba y se detectaba en las líneas de callos de arroz transgénico que contenían el promotor OsPSY1 corregido con 6 y 4 motivos. En conjunto, estos resultados confirman que el promotor corregido de OsPSY1 activó la expresión del gen. Los elementos reguladores cis tienen el potencial de regular OsPSY1, y cuando están presentes pueden activar el promotor de OsPSY1, apoyando fuertemente su papel en la expresión de OsPSY1 en el endospermo del arroz. Además, describimos una tercera estrategia para entender el papel de los factores de división del cloroplasto AtPDV1 y AtARC3 en la acumulación de carotenoides en el endospermo del arroz. Una de nuestras estrategias fue combinar los genes de división del cloroplasto (AtARC3 y AtPDV1) con genes carotenogénicos (ZmPSY1 y PaCRTI). Esta estrategia no dio lugar a diferencias significativas en la acumulación de carotenoides y en la cantidad de cromoplastos. En la segunda estrategia combinamos los factores de división de cloroplastos (AtARC3 y AtPDV1) con AtOrHis para potenciar la acumulación de carotenoides en el endospermo del arroz. Demostramos la co-transformación del arroz con los tres genes (AtARC3, AtPDV1 y AtOrHis). También confirmamos la acumulación de ARNm para los tres genes en el callo de arroz. Sin embargo, estamos lejos de identificar todos los factores necesarios que controlan la división y el número de cromoplastos. Serán necesarios más experimentos para identificar y caracterizar las proteínas que se asocian a estos factores con el fin de determinar su papel preciso en la acumulación de carotenoides en el endospermo del arroz.

My research project focused on investigations to better understand the mechanism of carotenoid accumulation in rice callus and endosperm. A major aim is to better understand the bottleneck of carotenoid biosynthetic pathway, by analyzing genes involved in carotenoid accumulation and their functionality for further use in metabolic engineering applications. The overall aims were to: 1) reconstitute a native carotenoid pathway in the rice endosperm by defining the minimum number of genes necessary to accumulate β-carotene; 2) restoring OsPSY1 expression in the endosperm by re-activation of the promoter; 3) test if chloroplast division factor genes in combination with carotenogenic genes enhance carotenoid accumulation in rice endosperm. PSY1 commits the first step of the carotenoid biosynthetic pathway. In rice endosperm, the PSY1 promoter is not active so the first part of my work has been to define the minimum number of necessary genes to accumulate β-carotene in rice endosperm. In early experiments, rice plants were transformed with OsPSY1 and OsPDS. The results indicated that the combination of these two genes leads to the accumulation of β-carotene in rice callus. However, co-transformation of the subsequent genes (OsZDS, OsZISO and OsCRTISO) will be important for the full understanding of each genes and the function in the accumulation of carotenoid in rice endosperm. Future work needs to focus on generating a population of transgenic rice plants with the combination of all the above genes in order to dissect the function of each gene in the pathway. The second part of my project was focus on the reactivation of the OsPSY1 gene promoter specifically in rice endosperm. To achieve this aim, we identified six potential endosperm specific cis-regulatory elements in the promoter region of OsPSY1: three prolamin p-boxes, one AACA motif, one GCN4-like motif and an Opaque 2 box (O2 box). To test our hypothesis, we constructed two synthetic OsPSY1 promoters with 6-motif and 4-motif corrected driving GFP. The wild type version of OsPSY1 promoter under the control of GFP was used as a negative control. The results confirmed that GFP was highly expressed and the GFP protein was accumulated and detected in the transgenic rice callus lines containing the corrected 6- and 4-motif OsPSY1 promoter. Taken together, these results confirm that the corrected OsPSY1 promoter activated gene expression. The cis-regulatory elements have the potential to regulate OsPSY1, and when present they can activate the OsPSY1 promoter, strongly supporting their role in the expression of OsPSY1 in rice endosperm. Moreover, we describe a third strategy to understand the role of the plastid division factors AtPDV1 and AtARC3 in the accumulation of carotenoids in rice endosperm. One of our strategies was to combine the plastid division genes (AtARC3 and AtPDV1) with carotenogenic genes (ZmPSY1 and PaCRTI). This strategy did not result in any significant differences in carotenoid accumulation and chromoplast quantity. In the second strategy we combined the plastid division factors (AtARC3 and AtPDV1) with AtOrHis in order to enhance carotenoid accumulation in the rice endosperm. We demonstrate co-transformation of rice with the three genes (AtARC3, AtPDV1 and AtOrHis). Also we confirmed mRNA accumulation for the three genes in rice callus. However, we are far from identifying all the necessary factors controlling chromoplast division and number. Further experiments will be required to identify and characterize proteins that associate with these factors in order to determine their precise role in the accumulation of carotenoids in the rice endosperm.