In vitro natural remineralization of enamel: Characterization by conventional and synchrotron radiation-based techniques

Abstract

El desarrollo de tecnologías para reconstruir el esmalte dental y restaurar la estructura del diente es de vital importancia teniendo en cuenta la incapacidad del esmalte maduro para regenerarse tras un daño sustancial. Los productos con flúor ampliamente utilizados pueden prevenir la desmineralización y promover la remineralización en las superficies de los dientes sustituyendo los iones hidroxilo por iones fluoruro. Esta interacción forma fluorapatita en el esmalte dental, más resistente a los ácidos y estable, en lugar de hidroxiapatita (mineral original del esmalte). En el presente estudio se utiliza un enfoque diferente para inducir la remineralización, a fin de evitar las altas concentraciones de flúor con sus efectos secundarios y prolongar el tiempo de contacto entre los iones fluoruro y los dientes. Este trabajo pretende desarrollar un material dental innovador para remineralizar el esmalte dental mediante una combinación apropiada de resinas de intercambio iónico para la liberación controlada de los iones minerales que forman el esmalte dental, en presencia de amelogenina humana para guiar un adecuado crecimiento de los cristales. El novedoso producto propuesto consiste en una combinación de resinas de intercambio iónico (ácido débil y base débil) cargadas individualmente con los iones remineralizantes: Ca2+, PO43- y F-, incluyendo también Zn2+ en una cantidad menor como agente antibacteriano, junto con la proteína amelogenina. Dicho cóctel proporciona una liberación controlada in situ de los iones necesarios para la remineralización del esmalte que evita la precipitación de compuestos indeseados por el encuentro masivo de iones fuera de la superficie del esmalte, y al mismo tiempo, una guía para el crecimiento de los cristales por la proteína indicada. La proteína amelogenina está implicada en el desarrollo estructural del esmalte natural y desempeña un papel clave en el control de la morfología y la alineación del crecimiento de los cristales en la superficie del esmalte dental. Los dientes tratados se evaluaron utilizando técnicas convencionales y técnicas basadas en la fuente de luz de sincrotrón. Las limitaciones para evaluar la remineralización del esmalte dental se han superado gracias a una metodología resultante de la combinación adecuada de la radiación de sincrotrón, aplicada tanto a la microespectroscopia infrarroja como a la microdifracción de rayos-X, con la ayuda de la aplicación específica de minería de datos. Estos datos de sincrotrón, analizados con método quimiométrico adecuado, nos permiten estudiar la evolución de la estructura de las apatitas y su distribución tras el proceso de remineralización. De este modo, pudimos alcanzar la resolución espacial necesaria para determinar los cambios en la remineralización en función de la profundidad gracias a la calidad de los datos proporcionada por la fuente de luz de sincrotrón, particularmente gracias a la excepcional relación señal/ruido. Los datos de sincrotrón se trataron mediante el análisis de componentes principales y la resolución multivariante de curvas para analizar la capa mineral formada en presencia y ausencia de amelogenina, con el fin de determinar la influencia de la proteína en los cambios morfológicos del esmalte remineralizado. Este innovador material induce la remineralización dental creando una capa de fluorapatita libre de impurezas de carbonato, con una dureza equivalente a la del esmalte sano y la adecuada alineación de los correspondientes nanocristales gracias a la contribución de la amelogenina, siendo la fluorapatita más resistente a los ácidos que el mineral original. Los resultados sugieren que el nuevo producto muestra potencial para inhibir la desmineralización y promover la remineralización a largo plazo, lo que supondría la inhibición de la progresión de la caries y la protección de las estructuras dentales.

Developing technologies to reconstruct dental enamel and restore tooth structure is of vital importance considering the inability of mature enamel to regenerate itself after substantial damage. Widespread fluoride products can prevent demineralization and promote remineralization on tooth surfaces by replacing hydroxyl ions with fluoride ions. This interaction forms more acid-resistant and stable fluorapatite in the dental enamel instead of hydroxyapatite (original natural enamel mineral). A different approach to induce remineralization is used in the present study to avoid high concentrations of fluoride with its side effects and prolong the contact time between fluoride ions and teeth. This work aims to develop an innovative dental material to remineralize tooth enamel by a proper combination of ion-exchange resins as controlled release of mineral ions forming dental enamel, in presence of human amelogenin to guide the appropriate crystal growth. The novel product proposed consists of a combination of ion-exchange resins (weak acid and weak base) individually loaded with the remineralizing ions: Ca2+, PO43- and F-, also including Zn2+ in a minor amount as antibacterial agent, together with the protein amelogenin. Such cocktail provides onsite controlled release of the ions necessary for enamel remineralization avoiding the precipitation of undesired compounds by massive encounter of related ions outside of the enamel surface, and at the same time, a guiding tool for crystal growth by the indicated protein. Amelogenin protein is involved in the structural development of natural enamel and takes a key role in controlling the crystal growth morphology and alignment at the dental enamel surface. Treated teeth were evaluated by using conventional techniques as well as techniques based in synchrotron light source. The limitations to assess dental enamel remineralization have been overcome by a methodology resulting from the appropriate combination of synchrotron radiation-based techniques on both, infrared microspectroscopy and micro X-ray diffraction, with the help of specific data mining. The appropriate synchrotron data obtained, analysed with the proper chemometric method, allow us to study the evolution of the structure of apatites and their distribution after the remineralization process. Thus, we could reveal the spatial resolution required to determine the changes in the remineralization as a function of the depth thanks to the goodness of data provided by the synchrotron source, in particular the unique enhanced signal-to-noise ratio. The synchrotron data were treated using principal component analysis and multivariate curve resolution to analyze the mineral layer formed in the presence and absence of amelogenin in order to determine the protein influence on the morphological changes of the remineralized enamel. The innovative material induces the dental remineralization creating a fluorapatite layer free of carbonate impurities, with a hardness equivalent to sound enamel and the appropriate alignment of the corresponding nanocrystals thanks to amelogenin contribution, being the fluorapatite more acid-resistant than the original mineral. Our results suggest that the new product shows potential for inhibiting demineralization and promoting long-term remineralization leading to the inhibition of caries progression and protection of dental tissues structures.