Molecular mechanisms of plastidial differentiation

Abstract

Los carotenoides son isoprenoides que tanto los organismos fotosintéticos como algunos no fotosintéticos producen. Tienen funciones relacionadas con la fotosínte sis, la fotoprotección, la señalización y la pigmentación. A pesar de que los humanos no podemos sintetizarlos, los carotenoides proporcionan propiedades nutricionales muy favorables para nuestra salud, principalmente por su papel como precursores de vitamina A. Las plantas sintetizan carotenoides en los plastos a partir del geranil geranil difosfato (GGPP) que se sintetiza a partir de la ruta del metileritritol 4-fosfato (MEP). Los cromoplastos son plastos especializados en la producción y acumulación de carotenoides que normalmente se originan por la diferenciación a partir de cloro plastos, pero el mecanismo de diferenciación no ha sido identificado. La transición cloroplasto-cromoplasto solo ocurre en algunos órganos de algunas especies, nor malmente en paralelo con otros muchos procesos como todos aquellos relacionados con la maduración del fruto. El objetivo de esta tesis doctoral ha sido la caracteri zación de un sistema artificial de diferenciación cloroplasto-cromoplasto en hojas de Nicotiana benthamiana, desencadenado por la expresión transitoria del gen bacteri ano crtB, que codifica una fitoeno sintasa, el primer paso de la ruta biosintética de carotenoides. Para una mejor caracterización de nuestro sistema artificial, inicialmente nos enfocamos en hojas de N. benthamiana cuatro días después de la agroinfiltración con crtB (una vez que un fenotipo amarillo estaba plenamente establecido), y las comparamos con regiones de las mismas hojas expresando GFP como control de agroinfiltración. Las regiones que expresaban crtB acumulaban fitoeno, aumentaban el contenido de carotenoides totales, detenían su actividad fotosintética y cambia ban la morfología de sus plastos hacia una similar a cromoplastos. De hecho, este fenotipo solamente se inducía cuando crtB se localizaba en los plastos, produciendo fitoeno a partir del GGPP derivado de la ruta del MEP. El análisis de RNA-seq a las 96 horas post-infiltración (hpi) mostró unos perfiles de transcripción globales con similaridades con el sistema de maduración de fruto en tomate (en el que los cloro plastos se diferencian en cromoplastos de forma natural) pero no con el proceso de senescencia en hojas de Arabidopsis thaliana (donde los cromoplastos degeneran a gerontoplastos). Para respaldar nuestros resultados, anotamos un nuevo genoma de N. benthamiana, utilizando genes de Arabidopsis como referencia e identificando homólogos para diferentes familias génicas. ix La segunda pare de la tesis estuvo enfocada en describir los eventos de ex presión génica durante la transición cloroplasto-cromoplasto. Un segundo exper imento de RNA-seq se llevó a cabo, abarcando ocho puntos desde las 22 a las 56 hpi. Los análisis de estos datos usando el nuevo genoma anotado de N. benthamiana y la comparación de los resultados con experimentos de RNA-seq enfocados en la diferenciación cloroplasto-cromoplasto en frutos mostró se trata de un proceso muy heterogéneo entre distintas especies vegetales, compartiendo solamente un pequeño porcentaje de sus perfiles de expresión génica. En N. benthamiana, se encontraron dos picos de cambios de expresión que correlacionan con las caídas en la actividad foto sintética: uno al principio y otro al final del proceso, con una etapa de relajación entre medias. Se observó un primer evento de represión en la expresión que afectaba a la expresión génica relacionada con el metabolismo primario y las chaperonas, proba blemente causado por el consumo de GGPP o por una respuesta ante la presencia de crtB. Esta represión fue seguida de una inducción en la expresión correlacionada con la acumulación de fitoeno y el descenso de la fotosíntesis, que afectaba a la expresión de genes de la ruta del MEP y genes relacionados con el ácido jasmónico (JA). El pico final de cambio en la expresión génica ocurrió simultáneamente con el segundo y definitivo evento de reducción fotosintética y el incremento de carotenoides totales. Los niveles hormonales de JA incrementaron en este último evento, mientras que los genes de la biosíntesis de carotenoides no estuvieron afectados durante el exper imento. Además de contribuir a un mejor entendimiento de la cromoplastogénesis, estos resultados proveen de anotaciones realizadas in-silico para futuros estudios en N. benthamiana.

Carotenoids are isoprenoids produced by all photosynthetic and some non photosynthetic organisms. They have functions related to photosynthesis, photo protection, pigmentation and signaling. Despite humans cannot synthesize them, carotenoids provide important nutritional and health-promoting properties, mainly as vitamin A precursors. Plants synthesize carotenoids in plastids from geranylger anyl diphosphate (GGPP) synthesized by the methylerythritol 4-phosphate (MEP) pathway. Chromoplasts are plastids specialized in carotenoid production and ac cumulation which are usually differentiated from pre-existing chloroplasts, but the differentiation mechanism remains unknown. Chloroplast-to-chromoplast transi tion only occurs in some organs of some plant species, normally in parallel to many other processes such as those related to fruit ripening. The goal of this thesis work has been to characterize an artificial system of chloroplast-to-chromoplast differen tiation in leaves of Nicotiana benthamiana, triggered by the transient expression of the bacterial crtB gene which encode a phytoene synthase, the first step of the carotenoid biosynthetic pathway. To better characterize our artificial system, we initially focused on N. benthami ana leaves four days after the agroinfiltration with crtB (once a yellow phenotype was fully established), and compared them to regions of the same leaves express ing GFP as a control. crtB-expressing leaves accumulated phytoene, increased total carotenoid content, stopped their photosynthetic activity and changed the morphol ogy of their chloroplats to chromoplast-like plastids. Strikingly, this phenotype was only induced when crtB localized in plastids, producing phytoene from GGPP de rived from the MEP pathway. RNA-seq at 96 hours post-infiltration (hpi) showed global transcription profiles with similarities to the tomato fruit ripening system (where chloroplasts naturally differentiate into chromoplasts) but not to the leaf senescence process in Arabidopsis thaliana (where chloroplasts degenerate to become gerontoplasts). To support our results, a new genome of N. benthamiana was anno tated, using Arabidopsis genes as reference and identifying homologs for different gene families. The second part of the thesis was focused on describing gene expression events during chloroplast-to-chromoplast transition. A second RNA-seq experiment was carried out encompassing eight time-points, from 22 to 56 hpi. Analysis of these data using the newly annotated N. benthamiana genome and comparison of the results with RNA-seq experiments covering chloroplast-to-chromoplast differentiation in vii fruits showed that this process is very heterogenous among different plant systems, sharing just a small proportion of their gene expression profiles. In N. benthamiana, two peaks were found in gene expression changes that correlated with drops in pho tosynthetic activity: one at the beginning and another at the end of the time course, with a relaxation in the middle. A first event of down-regulation affected primary metabolism and chaperone gene expression, probably caused by GGPP consump tion or as a response to crtB presence. This down-regulation was followed by an up-regulation correlated to the first event of phytoene accumulation and photosyn thesis decrease that affected MEP pathway and jasmonic acid (JA) related gene ex pression. The final peak of gene expression changes occurred simultaneously with the second and definite event of photosynthesis reduction and total carotenoid in crease. JA hormone levels increased at this last event, while carotenoid biosynthesis genes were not affected during the investigated time-course. Besides contributing to a better understanding of chromoplastogenesis, these results provide in-silico cu rated annotations for future studies in N. benthamiana. V