Radical dendrimers as Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents

Abstract

El objetivo principal de esta Tesis es desarrollar agentes de contraste (AC) para imagen de resonancia magnética (MRI), libres de metales y menos tóxicos que los utilizados actualmente en el diagnóstico clínico basados en Gd (III). Los dendrímeros son polímeros monodispersos con una estructura molecular bien definida, que pueden ser el soporte perfecto para anclar radicales orgánicos en sus ramas. Es lo que se denomina un 'dendrímero radical'. En estos compuestos se puede mejorar las relajatividad y proporcionar un efecto protector a los radicales ofreciéndoles protección contra la reducción. Uno de los mayores desafíos en la síntesis de AC para aplicaciones biomédicas es hacerlos solubles en agua. Además, el agente debe presentar alta relaxividad, baja toxicidad y buena biocompatibilidad. En esta Tesis utilizamos diferentes estrategias para preparar dendrímeros radicales solubles en agua, jugando con diferentes tipos de dendrímeros, enlaces y estructuras supramoleculares. Los aminoácidos pueden ser un medio de enlace ideal para preparar dendrímeros solubles. Se han elegido tirosina y lisina como conectores entre las ramas del dendrímero polifosforhidrazona (PPH) y los radicales PROXYL. En el grupo se había iniciado la síntesis de cuatro generaciones de dendrímeros radicales de PPH con tirosina como enlazador (Gn-Tyr (PROXYL)-COOLi, n = 0-3). Son solubles en agua, presentan alta relajatividad (desde 1,39 mM- 1s- 1 en G0 a 12,96 mM-1s-1 en G3) y baja citotoxicidad. Con lisina se han sintetizado cuatro generaciones de dendrímeros de PPH (Gn-Lys(BOC)-COOMe, n = 0-3). Sin embargo, en condiciones ácidas, en generaciones superiores a G0, el enlace P-N no es estable. Hemos podido determinar que el G1-Lys(BOC)-COOLi presenta liberación de lisina a pH 7,7. Por lo tanto, se puede controlar la degradación del dendrímero mediante la variación del pH, abriendo un nuevo campo de investigación. Otra estrategia ha sido el uso de dendrímeros que son solubles en agua, como aquellos basados en oligoetilenglicol (OEG). Se han sintetizado y caracterizado dos generaciones de dendrímeros funcionalizados con 5 y 20 radicales PROXYL. Son solubles en agua, no citotóxicos y tienen una buena relajatividad: el dendrímero radical G1-OEG-PROXYL tiene un valor de r1 (3.4 mM−1s−1) similar al del Gd-DTPA (3.2 mM−1s−1) ampliamente utilizado en clínica. Una tercera posibilidad es el uso de compuestos anfifílicos para preparar estructuras supramoleculares autoensambladas como nanopartículas. Hemos utilizado polímeros dendrítico-lineal-dendrítico basados en dendrones (bis-MPA) al final de una cadena de poli (etilenglicol). Se han sintetizado tres generaciones diferentes mediante química click (G1-, G2- y G3-MPA-PEG20k-TEMPO) y se ha obtenido una suspensión homogénea de nanopartículas G2 (G2NPs) en agua. Mientras que los G2NP forman nanopartículas esféricas, el G2 disuelto directamente en agua forma nanofibras. No son citotóxicos y los G2NP presentan una relajatividad ligeramente mayor que el G2. También hemos explorado la posibilidad de obtener no solo dendrímeros magnéticos sino también fluorescentes para tener AC bimodales para aplicaciones de imagen de resonancia magnética y fluorescencia. Hemos sintetizado seis dendrímeros radicales basados en oligo (estiril)benceno fluorescentes. En disolventes orgánicos, estos compuestos presentan simultáneamente fluorescencia y relajatavidad. Para obtener estos compuestos en solución acuosa, se han encapsulado preparando micelas de CTAB. Dichos sistemas, con los dendrímeros radicales en su interior, mantienen las propiedades magnéticas y fluorescentes. Finalmente, se ha estudiado tanto en ratones sanos como portadores de glioblastoma GL261, la capacidad de contraste in vivo del dendrímero radical G3-Tyr(PROXYL)-COONa (G3). Los estudios de biodistribución muestran una mejora del contraste principalmente en la corteza renal y la pelvis, así como una acumulación selectiva del dendrímero radical en el tumor cerebral. G3 proporciona una mejora de contraste similar a los AC comercial basados en Gd y un mayor tiempo de circulación en él organismo.

The main objective of this Thesis is to develop metal-free contrast agents (CA) for magnetic resonance imaging (MRI) to overcome the stablished toxicity of the most widely used CA in clinical diagnosis based on Gd(III) complexes. Dendrimers are monodisperse polymers with a well-defined molecular structure, which can be a perfect support for anchoring organic radicals, what is called 'radical dendrimer'. In these compounds the relaxivities can be improved and a shielding effect can be provided to the radicals offering them protection against reduction. One of the greatest challenges in the synthesis of CA for biomedical applications is to make them water-soluble. Besides, CA should present high relaxivity, low toxicity and good biocompatibility. In this Thesis we use different strategies to prepare water-soluble radical dendrimers, by playing with different types of dendrimers, linkers and supramolecular structures. Amino acids can be ideal linkers for preparing water-soluble dendrimers because they provide an amino group for radical coupling, and an acid group that can provide negative charges conferring high solubility and low toxicity. Tyrosine and lysine have been chosen as linkers between polyphosphorhydrazone (PPH) dendrimer branches and PROXYL radicals. In the group it had been started the synthesis of four generations of PPH radical dendrimers with tyrosine as linker (Gn-Tyr(PROXYL)-COOLi, n=0-3). They are fully soluble in water, present high relaxivity (from 1.39 mM-1s-1 in G0 to 12.96 mM-1s-1 in G3), and no cytotoxicity. Lysine has been properly anchored to four generations of PPH dendrimers (Gn-Lys(BOC)-COOMe, n=0-3). However, under acid conditions the generations higher than G0 showed lysine release through P-N bond cleavage, preventing the obtaining of radical dendrimers with this linker. We have been able to determine that G1-Lys(BOC)-COOLi presents lysine release at pH 7.7. Therefore, these new lysine-functionalized PPH dendrimers can be used to prepare pH controlled degradable dendrimers or pH controlled release, opening a new field of research. Another strategy has been the use of dendrimers that are water-soluble themselves, in particular oligoethylene glycol (OEG) based dendrimers. Two generations of OEG-based dendrimers fully functionalized with 5 and 20 PROXYL radicals have been synthesized and characterized. They are soluble in water, non-cytotoxic and have a good relaxivity: G1-OEG-PROXYL radical dendrimer has a similar r1 relaxivity value (3.4 mM−1s−1) than Gd-DTPA (3.2 mM−1s−1) widely used in clinics. A third possibility is the use of amphiphilic compounds to prepare self-assembled supramolecular structures such as nanoparticles. We have used dendritic-linear-dendritic polymers based on (bis-MPA) dendrons at the end of a poly(ethylene glycol) chain. Three different generations have been synthesized by click chemistry (G1-, G2- and G3-MPA-PEG20k-TEMPO) and we have obtained homogeneous suspension of G2 nanoparticles (G2NPs) in water. While G2NPs form spherical nanoparticles, G2 directly dissolved in water forms nanofibers. They are non-cytotoxic and G2NPs present slightly higher relaxivity than G2, probably because of the higher rigidity of the former. We have also explored the possibility of obtaining not only magnetic but also fluorescent dendrimers to have bimodal CA for potential MRI and fluorescence imaging applications.We have synthesized six radical dendrimers based on fluorescent oligo(styryl)benzenes. In organic solvents these compounds present simultaneously fluorescence and relaxivity. In order to obtain these compounds in aqueous solution, CTAB micelles have been prepared to encapsulate them. Such systems, with the radical dendrimers inside, maintain both magnetic and fluorescent properties. Finally, the contrast ability in vivo of G3-Tyr(PROXYL)-COONa (G3) radical dendrimer has been described in healthy and GL261 glioblastoma-bearing mice. Biodistribution studies shows enhancement mostly in kidney cortex and pelvis, as well as a selective accumulation of the radical dendrimer in the brain tumor. G3 provides similar contrast enhancement than commercial Gd-based CA and a longer circulation time.