Nanotargeted endothelial progenitor cells-secretome therapy through endovascular delivery for ischaemic stroke

Abstract

L’ictus isquèmic segueix sent a dia d’avui una de les principals causes de mortalitat i discapacitat a nivell mundial. Així doncs, és essencial desenvolupar estratègies terapèutiques més enllà de la recanalització aguda. Tanmateix, la cerca de noves teràpies es veu limitada per l’elevada complexitat dels processos fisiopatològics derivats de l’ictus i pel repte que suposa l’arribada d’agents terapèutics al cervell. En aquest sentit, l’ús dels factors secretats per cèl·lules progenitores endotelials (secretoma d’EPCs) representa una estratègia prometedora per promoure la reparació neurovascular la qual estalviaria els riscos associats a les teràpies cel·lulars. Paral·lelament, la trombectomia mecànica per a la recanalització aguda després de l’ictus ha obert una nova possibilitat per administrar fàrmacs directament al cervell, i aquest abordatge podria millorar significativament gràcies a la nanomedicina. L’objectiu d’aquesta tesi doctoral ha estat augmentar l’arribada de fàrmacs al cervell per promoure la reparació neurovascular després de l’ictus isquèmic mitjançant l’administració intraarterial i el direccionament magnètic del secretoma d’EPCs en nanocàpsules polimèriques biocompatibles i biodegradables. Les nanocàpsules emprades per a aquest estudi han estat modificades per incorporar nanopartícules de ferro superparamagnètiques (SPIONs) i marcatges fluorescents per al seu direccionament magnètic i monitoratge mitjançant les tècniques d’imatge per ressonància magnètica i per fluorescència molecular, respectivament. L’estudi exhaustiu de la biodistribució d’aquestes nanocàpsules per mitjà de les tècniques esmentades ha demostrat, en un model d’ictus isquèmic en ratolins, que la ruta intraarterial en combinació amb el direccionament magnètic presenta un gran avantatge per augmentar de forma segura l’arribada al cervell. A més, s’ha observat l’acumulació de nanocàpsules a la regió cerebral infartada fins a una setmana després de l’administració, fet que afavoriria l’alliberament sostingut dels factors terapèutics encapsulats. Per altra banda, aquest treball ha demostrat, a través de l’estudi tant del contingut proteic total com de factors específics, la possibilitat d’encapsular aquest secretoma i preservar la seva funció pro-angiogènica un cop alliberat, tal com s’ha demostrat en models in vitro de cèl·lules endotelials. El present estudi demostra l’avantatge terapèutic de la implementació d’aquest abordatge nano-dirigit per a l’administració del secretoma d’EPCs, enfront de la teràpia lliure. Els resultats que es mostren aquí suggereixen que l’administració endovascular hiperaguda del secretoma d’EPCs, a la dosi testada, podria exacerbar el dany cerebral post-isquèmic, juntament amb una resposta neuro-inflamatòria incrementada i, per altra banda, promouria la formació de nous vasos sanguinis de manera ubiqua. En canvi, el tractament equivalent nano-dirigit permetria l’angiogènesi selectiva al teixit subjacent a l’infart sense els efectes nocius observats amb el tractament lliure. Com a pas previ cap a la translació de l’abordatge terapèutic proposat, s’han utilitzat porcs com a models d’animals grans amb cervells girencèfals (propers a l’humà) així com un model ex vivo de l’arbre vascular humà. Per una banda, s’ha pogut comprovar la seguretat de l’administració endovascular i la seva eficàcia per al nano-direccionament al cervell en porcs. Finalment, el direccionament de nanocàpsules administrades per via intraarterial i retenció amb camp magnètic també ha estat demostrat per l’ús en humans, en un model que simula l’anatomia i biodinàmica humanes. En conjunt, els resultats obtinguts en aquesta tesi doctoral posicionen l’ús de nanocàpsules magnètiques per via intraarterial com una estratègia prometedora per augmentar l’arribada de fàrmacs de forma específica al cervell, com per exemple el secretoma d’EPCs. Aquesta estratègia es podria implementar en el context clínic actual, amb l’ús de la trombectomia mecànica.

El ictus isquémico sigue siendo a día de hoy una de las principales causas de mortalidad y discapacidad a nivel mundial. Por ello, es esencial desarrollar estrategias terapéuticas más allá de la recanalización aguda. Sin embargo, la búsqueda de nuevas terapias se ve dificultada por la gran complejidad de los procesos fisiopatológicos derivados del ictus, y por el reto que supone la llegada de factores terapéuticos al cerebro. En este sentido, el uso de factores secretados por células progenitoras endoteliales (secretoma de EPCs) representa una estrategia prometedora para promover la reparación neurovascular, la cual evitaría los riesgos asociados a las terapias celulares. Por otro lado, la trombectomía mecánica para la recanalización aguda tras el ictus ha abierto una nueva posibilidad para administrar fármacos directamente al cerebro, y este abordaje podría mejorar significativamente gracias a la nanomedicina. El objetivo de la presente tesis doctoral consiste en aumentar la llegada de fármacos al cerebro con tal de promover la reparación neurovascular tras el ictus isquémico, mediante la administración intraarterial y la retención magnética del secretoma de EPCs en nanocápsulas poliméricas biocompatibles y biodegradables. Las nanocápsulas diseñadas para este estudio han sido modificadas con la incorporación de nanopartículas de hierro superparamagnéticas (SPIONs) y marcajes fluorescentes para su retención magnética y monitorización mediante el uso de las técnicas de imagen por resonancia magnética y por fluorescencia molecular, respectivamente. El estudio exhaustivo de la biodistribución de dichas nanocápsulas, mediante las técnicas mencionadas ha demostrado, en un modelo de ictus isquémico en ratones, que la ruta intraarterial en combinación con el direccionamiento magnético presenta una gran ventaja para aumentar de forma segura la llegada al cerebro. Además, se ha observado la acumulación de nanocápsulas en la región cerebral infartada hasta una semana tras la administración, lo que favorecería la liberación sostenida de los factores terapéuticos encapsulados. Por otro lado, este trabajo ha demostrado, mediante el estudio tanto del contenido proteico total como de factores específicos, la posibilidad de encapsular este secretoma y preservar su función pro-angiogénica una vez liberado, tal y como se ha demostrado en modelos in vitro de células endoteliales. Este estudio demuestra la ventaja terapéutica de la implementación de este abordaje nano-dirigido para la administración del secretoma de EPCs frente a la terapia libre. Los resultados que se muestran aquí sugieren que la administración endovascular hiperaguda del secretoma de EPCs, a la dosis testada, podría exacerbar el daño cerebral post-isquémico, junto a una respuesta neuro-inflamatoria incrementada y, por otro lado, promovería la formación de nuevos vasos sanguíneos de forma ubicua. Por lo contrario, el tratamiento equivalente nano-dirigido permitiría la angiogénesis selectiva en el tejido subyacente al infarto en ausencia de los efectos nocivos observados con el tratamiento libre. Como paso previo hacia la traslación del abordaje terapéutico propuesto, se han utilizado cerdos como modelos de animales grandes con cerebros girencéfalos (cercanos al humano), así como un modelo ex vivo del árbol vascular humano. Por un lado, se ha podido comprobar la seguridad de la administración endovascular y su eficacia para el nano-direccionamiento al cerebro en cerdos. Finalmente, el direccionamiento magnético de nanocápsulas administradas por vía intraarterial ha sido demostrado para el uso en humanos, en un modelo que simula la anatomía y la biodinámica humanas. En conjunto, los resultados obtenidos en esta tesis doctoral posicionan el uso de nanocápsulas magnéticas por vía intraarterial como una estrategia prometedora para incrementar la llegada de fármacos de forma específica al cerebro, como por ejemplo el secretoma de EPCs. Dicha estrategia se podría implementar en el contexto clínico actual con el uso de la trombectomía mecánica.

Stroke remains a leading cause of death and disability worldwide. Hence there is an urgent need to develop therapeutic strategies beyond acute recanalisation. However, this therapeutic development is hampered by a highly complex pathophysiology, added to the challenge of brain drug delivery. In this regard, endothelial progenitor cells (EPCs)-secretome represents a promising cell-free therapy for post-stroke neurovascular repair. Furthermore, mechanical thrombectomy for recanalisation has opened the window to brain drug delivery, which could be further improved by nanomedicine. This doctoral thesis aimed to enhance brain targeting and neurovascular repair in the context of cerebral ischaemia, through the endovascular delivery and magnetic retention of EPCs-secretome encapsulated in biocompatible and biodegradable polymeric nanocarriers. The proposed nanocarriers have been functionalised with superparamagnetic iron-oxide nanoparticles (SPIONs) and fluorescent tags for magnetic retention and magnetic resonance/fluorescent molecular imaging (MRI/FMI), respectively. An exhaustive study of their biodistribution by MRI/FMI has shown a great advantage of the intraarterial route combined with magnetic retention through focused magnet devices, to safely enhance brain targeting in a mouse model of cerebral ischaemia. And, importantly, it has been demonstrated that the nanocarriers remain in the target ischaemic brain up to one week, easing the sought-after sustained release of cargo therapeutic factors. Furthermore, the EPCs-secretome has been successfully encapsulated into the polymeric nanocarriers, as seen through both total and specific EPCs-secretome cargo proteins, and the pro-angiogenic therapeutic effects were preserved after the encapsulation-release process, as demonstrated in endothelial cell culture in vitro models. The present study demonstrates the advantage of the therapeutic application of EPCs-secretome through this selective nanotargeted approach against the equivalent free treatment at similar doses. The results presented herein suggest that hyperacute endovascular delivery of free EPCs-secretome, at the tested dose, might exacerbate the acute post-ischaemic brain damage along with an increased neuro-inflammatory response, while ubiquitously enhancing brain angiogenesis. In contrast, the nanotargeted treatment could selectively enhance brain angiogenesis in the target peri-infarct brain, in the absence of the aforementioned detrimental effects. As preliminary steps towards the translation of the proposed therapeutic approach to the clinical setting, large animals with gyrencephalic brains and an ex vivo humanised vascular model were also used. The present study demonstrates the safety and feasibility of endovascular delivery for brain nanotargeting in pigs, and the efficacy of endovascular delivery and magnetic retention in an ex vivo model adapted to the human vascular anatomy and biodynamics. In summary, this doctoral thesis places the use of polymeric magnetised nanocarriers through endovascular delivery as a promising approach to enhance specific brain targeting of multiple therapeutic agents, such as EPCs-secretome, which could be implemented in the context of mechanical thrombectomies in the clinical scenario.