Unravelling the pluripotency state of human embryonic stem cells derived from single blastomeres of 8-cell embryos

Abstract

Les cèl·lules mare embrionàries (ESCs) poden presentar almenys dos estats de pluripotència: naïve i primed, amb un perfil d’expressió gènica semblant al de l’epiblast preimplantacional i postimplantacional, respectivament. Les ESCs naïve presenten alguns avantatges respecte les primed que les fan més adients per a possibles usos clínics, com per exemple un major potencial de diferenciació i una major capacitat de proliferació i d’expansió clonal. També constitueixen un millor model in vitro per l’estudi dels esdeveniments del desenvolupament preimplantacional. Malgrat això, recentment s’ha demostrat l’existència d’estats de pluripotència intermedis i, per tant, la pluripotència s’ha de considerar com un espectre continu on els diferents tipus d’ESCs es posicionen en funció de les seves característiques. Les ESCs humanes (hESCs) tradicionalment derivades a partir d’embrions en estadi de blastocist presenten pluripotència primed. Les hESCs també poden ser derivades a partir de blastòmers aïllats d’embrions a 8 cèl·lules, però no es coneix amb certesa quin és el seu estat de pluripotència. Tenint en compte que provenen d’embrions en un estadi de desenvolupament primerenc, podrien ser més propenses a presentar característiques de pluripotència naïve. Per això, l’objectiu d’aquesta tesi ha estat determinar l’estat de pluripotència de les hESCs derivades a partir de blastòmers aïllats. En un primer treball, l’objectiu inicial fou derivar noves línies de hESC a partir de blastòmers aïllats (bm-hESCs) i de blastocists sencers (bc-hESCs) amb la major eficiència possible. Els resultats obtinguts van indicar que l’ús dels inhibidors de GSK3β i de ROCK va tenir un efecte positiu en les eficiències de derivació de hESCs. També es va observar que els blastòmers aïllats, com els blastocists, s’organitzaven formant un post-inner cell mass intermediate (PICMI) durant els primers dies del procés de derivació. A continuació es van analitzar diferents indicadors de pluripotència naïve en les bm-hESCs, les bc-hESCs (control primed) i una línia de hESCs convertida a naïve (control naïve) Les bm-hESCs van presentar una clonogenicitat significativament superior a la de les bc-hESCs, encara que inferior a la de les hESCs naïve, i també van presentar una expressió significativament superior d’alguns gens marcadors de pluripotència naïve a passatges primerencs de cultiu. En la resta d’indicadors, no es van observar diferències entre les bm-hESCs i les bc-hESCs, mentre que les hESCs naïve van ser significativament diferents. Aquests resultats van indicar que les bm-hESCs es trobarien en un estat de pluripotència primed, tot i que més proper a l’extrem naïve de l’espectre de la pluripotència que les bc-hESCs. Finalment, per tal de continuar amb el treball anterior, l’últim objectiu va consistir en analitzar el transcriptoma i el potencial de diferenciació de les bm-hESCs. Primer, es va observar que el transcriptoma de les bm-hESCs era semblant al de les bc-hESCs però significativament diferent al de les hESCs naïve. No obstant, les bc-hESCs van sobreexpressar gens relacionats amb el desenvolupament del sistema nerviós, l’especificació de patrons embrionaris i la morfogènesi de l’epiteli embrionari respecte les bm-hESCs, mentre que les bm-hESCs van sobreexpressar gens mitocondrials involucrats en la respiració cel·lular. Aquests resultats van anar en la línia dels obtinguts en el primer treball en referència a l’estat de pluripotència de les hESCs. En quant al potencial de diferenciació, no es van observar diferències entre les bm-hESCs, les bc-hESCs i les hESCs naïve com a grups, però si que es va observar una gran heterogeneïtat entre diferents línies. En conjunt, els resultats obtinguts en aquesta tesi indiquen que les bm-hESCs presenten un estat de pluripotència lleugerament més proper a l’extrem naïve de l’espectre de la pluripotència que les bc-hESCs, cosa que converteix els blastòmers aïllats en una alternativa interessant com a punt de partida per a la derivació de hESCs.

Las células madre embrionarias (ESCs) pueden presentar al menos dos estados de pluripotencia: naïve y primed, con un perfil de expresión génica similar al del epiblasto preimplantacional y postimplantacional, respectivamente. Las ESCs naïve presentan algunas ventajas respecto a las primed que las hacen más adecuadas para posibles usos clínicos, como por ejemplo un mayor potencial de diferenciación y una mayor capacidad de proliferación y de expansión clonal. También constituyen un mejor modelo in vitro para el estudio de los eventos del desarrollo preimplantacional. Sin embargo, recientemente se ha demostrado la existencia de estados de pluripotencia intermedios y, por lo tanto, la pluripotencia debe considerarse como un espectro continuo donde los diferentes tipos de ESCs se posicionan en función de sus características. Las ESCs humanas (hESCs) tradicionalmente derivadas a partir de embriones en estadio de blastocisto presentan pluripotencia primed. Las hESCs también pueden ser derivadas a partir de blastómeros aislados de embriones a 8 células, pero no se conoce con certeza su estado de pluripotencia. Teniendo en cuenta que provienen de embriones en un estadio de desarrollo temprano, podrían ser más propensas a presentar características de pluripotencia naïve. Por eso, el objetivo de esta tesis ha sido determinar el estado de pluripotencia de las hESCs derivadas a partir de blastómeros aislados. En un primer trabajo, el objetivo inicial fue derivar nuevas líneas de hESC a partir de blastómeros aislados (bm-hESCs) y de blastocistos enteros (bc-hESCs) con la mayor eficiencia posible. Los resultados obtenidos indicaron que el uso de los inhibidores de GSK3β y ROCK tuvo un efecto positivo en las eficiencias de derivación de hESCs. También se observó que los blastómeros aislados, como los blastocistos, se organizaban formando un post-inner cell mass intermediate (PICMI) durante los primeros días del proceso de derivación. A continuación, se analizaron diferentes indicadores de pluripotencia naïve en las bm-hESCs, las bc-hESCs (control primed) y una línea de hESCs convertida en naïve (control naïve) Las bm-hESCs presentaron una clonogenicidad significativamente superior a la de las bc-hESCs, aunque inferior a la de las hESCs naïve, y también presentaron una expresión significativamente superior de algunos genes marcadores de pluripotencia naïve en pasajes tempranos de cultivo. En el resto de los indicadores no se observaron diferencias entre las bm-hESCs y las bc-hESCs, mientras que las hESCs naïve fueron significativamente distintas. Estos resultados indicaron que las bm-hESCs se encontrarían en un estado de pluripotencia primed, aunque más cercano al extremo naive del espectro de la pluripotencia que las bc-hESCs. Por último, para continuar con el trabajo anterior, el último objetivo consistió en analizar el transcriptoma y el potencial de diferenciación de las bm-hESCs. Primero, se observó que el transcriptoma de las bm-hESCs era similar al de las bc-hESCs pero significativamente diferente al de las hESCs naïve. Sin embargo, las bc-hESCs sobreexpresaron genes relacionados con el desarrollo del sistema nervioso, la especificación de patrones embrionarios y la morfogénesis del epitelio embrionario respecto a las bm-hESCs, mientras que las bm-hESCs sobreexpresaron genes mitocondriales involucrados en la respiración celular. Estos resultados fueron en la línea de los obtenidos en el primer trabajo en referencia al estado de pluripotencia de las hESCs. En cuanto al potencial de diferenciación, no se observaron diferencias entre las bm-hESCs, las bc-hESCs y las hESCs naive como grupos, pero sí se observó una gran heterogeneidad entre diferentes líneas. En conjunto, los resultados obtenidos en esta tesis indican que las bm-hESCs presentan un estado de pluripotencia ligeramente más cercano al extremo naive del espectro de la pluripotencia que las bc-hESCs, lo que convierte a los blastómeros aislados en una alternativa interesante como punto de partida para la derivación de hESCs.

Embryonic stem cells (ESCs) can have at least two states of pluripotency: naïve and primed, with an expression profile resembling that of the preimplantation and postimplantation epiblast, respectively. Naïve ESCs have some advantages over primed ESCs that make them more suitable for potential clinical uses, such as a greater differentiation potential and a greater proliferation capacity and clonogenicity. They are also a better in vitro model than primed hESCs for the study of preimplantation developmental events. However, the existence of intermediate states of pluripotency has been recently reported, and therefore pluripotency should indeed be considered as a continuum where different types of ESCs are allocated according to their characteristics. Human ESCs (hESCs) traditionally derived from blastocyst stage embryos show a primed pluripotency state, but hESCs can also be derived from single blastomeres of 8-cell embryos, although their pluripotency state is unclear. Since they are obtained from embryos at an early stage of development, they could be more prone to present naïve pluripotency characteristics. Therefore, the objective of this thesis was to determine the pluripotency state of hESCs derived from single blastomeres. In a first study, the initial objective was to derive new hESC lines from single blastomeres (bm-hESCs) and from whole blastocysts (bc-hESCs) with the highest possible efficiency. The results indicated that the use of inhibitors of GSK3β and ROCK had a positive effect on hESC derivation efficiencies. We also observed that single blastomeres, like blastocysts, organized to form a post-inner cell mass intermediate (PICMI) during the first days of the derivation process. Next, different naïve pluripotency indicators were analysed in bm-hESCs, bc-hESCs (primed control), and a naïve-converted hESC line (naïve control). Our bm-hESCs showed a significantly higher clonogenicity than bc-hESCs, although lower than naïve hESCs, and also showed a significantly higher expression of some naïve pluripotency marker genes in early culture passages. No differences were observed between bm-hESCs and bc-hESCs for the rest of the indicators analysed, whereas naïve hESCs were significantly different. These results indicated that bm-hESCs would be in a primed state of pluripotency, although closer to the naïve end of the pluripotency continuum than bc-hESCs. Finally, in order to continue the previous work, the last objective was to analyse the transcriptome and the differentiation potential of bm-hESCs. First, we observed that the transcriptional profile of bm-hESCs was similar to that of bc-hESCs but significantly different from that of naïve hESCs. However, bc-hESCs overexpressed genes related to nervous system development, embryonic pattern specification, and embryonic epithelial morphogenesis with respect to bm-hESCs, whereas bm-hESCs overexpressed mitochondrial genes involved in cellular respiration. These results were consistent with those obtained in the first work with regards to the pluripotency state of hESCs. Referring to the differentiation potential, no differences were observed between bm-hESCs, bc-hESCs and naïve hESCs when treated as groups, but a large heterogeneity was observed between different hESC lines. All in all, the results obtained in this thesis indicate that bm-hESCs present a pluripotency state slightly closer to the naïve end of the pluripotency continuum than bc-hESCs, which makes single blastomeres an interesting alternative as a source for hESC derivation.