Anàlisi de patrons funcional i estructurals en la regulació del calci en les cèl·lules cardíaques

Abstract

In 2019 the data published by the World Health Organization showed that the cardiac ischemia is the first cause of death worldwide. These diseases are caused by irregularities of the contractile mechanism’s function, starting from the cellular level till the organ dysfunction. To further understand the origin of these dysfunctions the thesis will focus on the molecular and cellular level. The small changes of the physiology at that level can lead to an anomalous cardiac electrophysiology. The previous studies suggest that there is a relation between the cardiac arrhythmia and the increase of global spontaneous calcium activity in cells. Ryanodine receptors have the major role in the calcium regulation. They release the calcium stored in the sarcoplasmic reticulum into the cytosol, then the calcium attaches to the actin and myosin to produce the mechanical contraction of the cell. The irregularities have been also related with an hyperphosphorylation of the ryanodine receptor channels, which increases the open probability of those. A large amount of data is generated in the biology and physiology laboratories, these have to be characterized, clustered and analysed to extract the meaning of the observed divergences. Thus, an interdisciplinary thesis has been developed in order to obtain experimental data with a confocal microscope in the laboratory and then creating new image processing tools in order to have an interpretable analysis of the experimental data. The main objective of the project is to characterize the spontaneous calcium activity through image processing tools and to observe its variations under different physiological conditions, such as the hiperphosphorylation of the ryanodine receptor channels or under cardiac arrhythmia conditions. The aim is to see how the modifications in the calcium activity affect to the propagation along the cell and report how the variations may lead to electric and contractile dysfunctions, and so, cause arrhythmias. To reach this goals the thesis is divided into three main sections or hypothesis: 1. Experimental data acquisition, define the best image acquisition method in order to develop the studies of calcium images and proposal of methods to detect subcellular structures and spontaneous calcium events. 2. Study of the calcium events substructure and the involved ryanodine receptor clusters. Comparison of the calcium activity properties of the cells at the basal level and under conditions of hyperphosphorylation or arrhythmia. 3. Study of the physiological modifications in the calcium activity through different phosphorylation pathways.The results explain the ryanodine receptor clusters distribution through the cells, allow to have the localization of the channels and the calcium activity simultaneously and show relevant details such as, the increase in the duration of the events or the increase in the volume of calcium released when more ryanodine receptor clusters are co-activated. These modifications lead to have bigger events and, thus, more potentially dangerous because can depolarize the neighbouring cells. The parameters reflect the relationship between the phosphorylation of the ryanodine receptors and the spontaneous calcium release in the arrhythmogenesis process.

Segons les dades publicades per l'Organització Mundial de la Salut el 2019, la isquèmia cardíaca és la causa de mortalitat que ocupa el primer lloc a nivell mundial. Aquesta patologia és deguda a irregularitats en el funcionament del mecanisme contràctil, començant a nivell cel·lular, fins arribar a nivell d'òrgan. Per arribar a l'arrel d'aquestes disfuncions, en aquesta tesi es realitzarà un estudi a nivell cel·lular i molecular. Els petits canvis en aquest nivell poden arribar a escalar cap a una electrofisiologia cardíaca anòmala. Durant els darrers anys, els estudis de fisiologia cardíaca han relacionat les arítmies amb l'augment de l'activitat espontània de calci global a nivell cel·lular. Els principals encarregats de regular el calci en les cèl·lules dels miòcits cardíacs són els receptors de rianodina, que alliberen el calci emmagatzemat al reticle sarcoplasmàtic al citosol. Aquest s'uneix a l'actina i la miosina de la cèl·lula produint la contracció mecànica. Les irregularitats en l'activitat de calci han estat relacionades amb la fosforilació d'aquests canals, ja que un cop fosforil·lats la probabilitat d'obertura dels receptors augmenta. Als laboratoris de biologia i fisiologia es treballa amb volums relativament grans dades experimentals, que posteriorment s'han de caracteritzar, agrupar i donar un sentit als canvis observats. En vista d'aquest fet, s'ha volgut realitzar una tesi interdisciplinària, adquirint dades amb el microscopi confocal al laboratori i creant noves eines de processament d'imatges per facilitar una anàlisi interpretable de les dades experimentals. L'objectiu principal del projecte és caracteritzar l'activitat espontània del calci mitjançant tècniques de processament d’imatge i observar les variacions d'aquesta amb diferents condicions fisiològiques, com ara la fosforilació dels receptors de rianodina o amb cèl·lules de pacients amb arítmia. Veure com les modificacions en l'activitat de calci afecten a la propagació d'aquest al llarg de la cèl·lula i caracteritzar la perillositat de les variacions a l’hora d'induir un mal funcionament elèctric i contràctil i, per tant, donar a lloc arítmies. En motiu d'assolir aquest objectius la tesis es divideix en tres grans apartats o hipòtesis: 1. Obtenció de dades experimentals, definició del millor mètode per realitzar els estudis de les imatges de calci i proposta d’un mètode de detecció i quantificació d'estructures cel·lulars i esdeveniments de calci. 2. Estudi de la subestructura dels esdeveniments de calci i els clústers de receptors de rianodina involucrats. Comparació de les propietats de l'activitat de calci de les cèl·lules a nivell basal i sota condicions d'arítmia o fosforilació. 3. Estudi dels canvis electrofisiològics en l’activitat del calci emprant diferents vies de fosforilació dels canals de receptors de rianodina. Els resultats obtinguts expliquen la distribució dels receptors de rianodina en les cèl·lules, permeten tenir una visió de les activacions d'aquests canals durant l'activitat espontània de calci i mostren detalls rellevants, com ara l'augment de la durada, l'augment en el volum de calci alliberat i l'augment del nombre de clústers receptors de rianodina activats. Aquestes modificacions provoquen esdeveniments més grans i, per tant, més potencialment perillosos, ja que poden arribar a despolaritzar cèl·lules veïnes. Aquests paràmetres reflecteixen la relació entre la fosforilació dels receptors de rianodina i l'alliberament espontani de calci durant el procés d'aritmogènesi.