Role of iron content and endostatin expression in the progression of diabetic retinopathy

Abstract

La retinopatia diabètica és la principal causa de ceguera en la població adulta i s’espera que la seva prevalença continuï augmentant en els propers anys. Està dividida en una fase no proliferativa, en la que es donen alteracions vasculars i la ruptura de la barrera hematorretiniana, i una fase proliferativa, caracteritzada per la neovascularització. Tot i que la retinopatia diabètica ha estat extensament estudiada, la seva patogènesis és complexa i multifactorial, fet que dificulta el desenvolupament de teràpies efectives i fa necessari ampliar el coneixement sobre possibles nous mecanismes involucrats. En aquest sentit, la diabetis mellitus ha estat relacionada amb un increment de ferro sistèmic, el qual podria causar dany oxidatiu en la retina i empitjorar la progressió de la retinopatia diabètica. Malgrat això, encara no se sap com l’excés de ferro sistèmic i la barrera hematorretiniana determinen el contingut de ferro en la retina durant la retinopatia diabètica. Pel que fa a la neovascularització pròpia de la fase proliferativa, es considera que està causada per un desequilibri entre factors angiogènics i antiangiogènics. L’endostatina és el factor antiangiogènic més potent conegut en la retina i podria tenir un paper clau en el desenvolupament de la neovascularització. Els objectius principals d’aquest treball han estat l’anàlisi de la funció de la barrera hematorretiniana en l’homeòstasi del ferro en la retina i la caracterització de l’expressió d’endostatina durant la retinopatia diabètica. Els experiments s’han desenvolupat en un model de diabetis tipus 2, el ratolí db/db, i en mostres de pacients humans. Els resultats donen suport al fet que durant la diabetis hi ha un increment de ferro sistèmic. A més, aquesta investigació demostra que la retina està estretament protegida per la barrera hematorretiniana en front als augments de ferro sistèmic i que el ferro només entra massivament a la retina quan aquesta es trenca. La retina podria també detectar el augment del ferro sistèmic augmentant l’expressió de ferritina, proteïna encarregada d’emmagatzemar ferro i evitar el dany oxidatiu. Aquest fet suggereix la existència d’un mecanisme de regulació autònom en la retina previ al trencament de la barrera hematorretiniana i a l’augment de ferro en la retina. Aquesta treball també ha mostrat per primera vegada l’expressió d’endostatina a nivell intracel·lular en cèl·lules bipolars i en fotoreceptors, tant en humà com en ratolí. A més a més, les retines dels ratolins diabètics presenten una disminució en l’expressió d’endostatina, el què provocaria un ambient propens a la neovascularizació. D’acord amb això, els ratolins db/db presenten vasos en el vitri sortint del disc òptic amb característiques de neovasos. En conclusió, aquesta tesi proporciona coneixement sobre el paper de la barrera hematorretiniana en condicions de sobrecàrrega de ferro i sobre la disminució de l’ endostatina durant la retinopatia diabètica. Aquesta recerca, per tant, obre la porta a possibles teràpies que es podrien fer servir per combatre la progressió de la malaltia.

La retinopatia diabética es la principal causa de ceguera en la población adulta y se espera que su prevalencia continue aumentando en los próximos años. Se divide en una fase no proliferativa, en la que se dan alteraciones vasculares y la rotura de la barrera hematorretiniana, y una fase proliferativa, que se caracteriza por la neovascularización. Aunque la retinopatia diabética ha sido extensamente estudiada, su patogénesis es compleja y multifactorial, hecho que dificulta el desarrollo de terapias efectivas y hace necesario ampliar el conocimiento sobre posibles nuevos mecanismos involucrados. En este sentido, la diabetes mellitus se ha relacionado con un incremento de hierro sistémico, el cual podría causar daño oxidativo en la retina y empeorar la progresión de la enfermedad. Sin embargo, aún no se sabe cómo el exceso de hierro sistémico y la barrera hematorretiniana determinan el contenido de hierro en la retina durante la retinopatia diabética. En cuanto a la neovascularización propia de la fase proliferativa, se considera que está causada por un desequilibrio entre factores angiogénicos y antiangiogénicos. La endostatina es el factor antiangiogénico más potente conocido en la retina y podría tener un papel clave en el desarrollo de la neovascularización. Teniendo esto en cuenta, los objetivos principales de este trabajo han sido el análisis de la función de la barrera hematorretiniana en la homeostasis del hierro en la retina y la caracterización de la expresión de endostatina durante la retinopatia diabética. Los experimentos se han desarrollado en un modelo de diabetes tipo 2, el ratón db/db, y en muestras de pacientes humanos. Los resultados apoyan el hecho de que durante la diabetes hay un incremento de hierro sistémico. Además, esta investigación demuestra que la retina está estrechamente protegida por la barrera hematorretiniana frente a aumentos de hierro sistémico, ya que el hierro sólo entra masivamente en la retina cuando la barrere se rompe. La retina podría también detectar el augmento de hierro sistémico aumentando la expresión de ferritina, proteína encargada de almacenar hierro y evitar el daño oxidativo. Este hecho sugiere la existencia de un mecanismo de regulación autónomo en la retina previo a la rotura de la barrera hematorretiniana y al aumento de hierro en la retina. Este trabajo también ha mostrado por primera vez la expresión de endostatina a nivel intracelular en las células bipolares y en los fotorreceptores, tanto en humano como en ratón. Además, las retinas de los ratones diabéticos presentan una disminución en la expresión de endostatina, lo que provocaría un ambiente propenso a la neovascularización. De acuerdo con esto, los ratones db/db presentan vasos intravítreos que protruyen del disco óptico con características de neovasos. En conclusión, esta tesis proporciona conocimiento sobre el papel de la barrera hematorretiniana en condiciones de sobrecarga de hierro sistémico y sobre la disminución de la endostatina durante la retinopatia diabética. Esta investigación abre la puerta a posibles terapias que se podrían utilizar para combatir la progresión de la enfermedad.

Diabetic retinopathy (DR) is a leading cause of visual impairment in adults and its prevalence is expected to increase in the next years. DR can be divided into non-proliferative (NPDR), in which the retina suffers from microvascular changes and blood-retinal barrier (BRB) breakdown, and proliferative diabetic retinopathy (PDR), characterized by neovascularization. Although DR has been extensively studied, it has a complex and multifactorial pathogenesis that challenges the development of effective therapies. In this regard, new mechanisms involved in DR should be studied to increase the knowledge of the disease. Diabetes mellitus has been related to an increase of systemic iron content which could affect the retina causing oxidative damage and exacerbating the pathogenesis of DR. However, how systemic iron excess and BRB status determine retinal iron dysregulation during DR remains unclear. Furthermore, pathological neovascularization during PDR takes place due to an imbalance between angiogenic and antiangiogenic factors. In this regard, endostatin, the most powerful antiangiogenic factor known in the retina, could have a key role in PDR development. The main objectives of the present work have been the analysis of the role of BRB in retinal iron homeostasis and the characterization of endostatin expression in the retina during DR. The experiments have been performed in the db/db mice, a model that develops type 2 diabetes, and in human samples. The results of this work support the fact that diabetes courses with systemic iron overload. Furthermore, this research demonstrated that the retina is tightly protected against systemic iron overload by the BRB, which only allows massive entry of iron when is compromised. Moreover, the retina is capable to detect systemic iron overload and increase its ferritin expression, an iron storage protein with antioxidant activity, suggesting an autonomous regulatory mechanism prior to BRB breakdown and iron increase in the retina. This work also showed for the first time intracellular expression of endostatin in the retina, mainly in bipolar cells and photoreceptors, in both human and mouse. Furthermore, endostatin was decreased in db/db mouse retinas, creating an environment prone to neovascularization. Accordingly, intravitreal vessels protruding from the optic disc mimicking neovascularization were found in db/db mouse. Overall, this thesis provides an insight on the understanding of the role of the BRB during iron overload and the decrease of endostatin during DR. Thus, offering a guidance on the potential therapies that could be used.