Biomarkers and therapeutic targets based on bacterial “Quorum Sensing” system

Abstract

Infectious diseases are still one of the main leading causes of death worldwide mainly due the overuse and the lack of development of new antibiotics. This fact has increased the appearance of multidrug resistance (MDR) bacteria strains resulting in a growing number of infections difficult to treat with conventional drugs. In this context, Pseudomonas aeruginosa gram negative bacterium presents great interest since it is a MDR bacterium causing a high number of infections, especially nosocomial infections. Moreover, it is one of the most predominant pathogen in patients with cystic fibrosis. Usually, P. aeruginosa infections can be categorized as acute and chronic, but this classification is not always obvious. Acute infections are frequent during early stages of infection and associated with a planktonic lifestyle and with high levels of virulence factors (VFs) production. In contrast, chronic infections are characterized by a lower VF production and the formation of biofilms and persiter cells, which confer high resistance to antibiotics. The development of pathogenesis and the transition between acute and chronic infections are regulated by a bacterial communication system called Quorum Sensing (QS), which controls the expression of a myriad of genes in response to the presence of small signal molecules called autoinducers. In consequence, QS has attracted attention as a promising target to develop diagnostic and therapeutic approaches. Although being a time-consuming technique, which delays treatment administration with the consequences that this entails, the gold standard technique used for P. aeruginosa detection is still based on plate culture. Thus, there is a clear need to obtain rapid and sensitive diagnostic techniques. Within this framework, a highly sensitive, specific and rapid immunochemical assay has been developed to detect one of the main VF of P. aeruginosa, pyocyanin (PYO), in less than 2 h using a high affinity monoclonal antibody (mAb) against it. The low limit of detection of the assay has allowed PYO detection in bacterial isolates from patients infected with P. aeruginosa and its validation as potential biomarker of these infections. In the light of the obtained results, further investigations have been assessed on analysing directly clinical samples, such as sputa and swab samples from patients infected with this pathogen. Furthermore, based on QS system and on the use of specific mAbs against key molecules of this system, a new therapeutical approach to treat P. aeruginosa infections has been studied. In this context, the quenching activity of PYOmAb has been assessed using a developed cell based in vitro system. First, the cytotoxic effect caused by PYO has been evaluated on murine macrophages studying different hallmarks of viability since this VF is known to exert a large number of toxic effects in host cells. Subsequently, the protective effect of PYOmAb on the same cell line has been analysed obtaining a high increase of viability percentages (50 - 80 %). Apart from studying an effector molecule, the quenching of a signalling molecule, such as Pseudomonas Quinolone Signal (PQS), has been also adressed using the same in vitro system. In this case, the protection levels obtained have been even better reaching 80 - 100 % viability levels. Thus, the obtaines results has demonstrated the potential of these mAbs as therapeutic agents.

Las enfermedades infecciosas siguen siendo una de las principales causas de muerte en todo el mundo debido principalmente al uso excesivo y la falta de desarrollo de nuevos antibióticos. Este hecho ha incrementado la aparición de cepas bacterianas resistentes a múltiples fármacos (multiresistentes), lo que ha dado lugar a un número creciente de infecciones difíciles de tratar con fármacos convencionales. En este contexto, la bacteria gram negativa Pseudomonas aeruginosa presenta gran interés al tratarse de un patógeno multiresitente causante de un elevado número de infecciones, especialmente infecciones nosocomiales. Además, es una de las bacterias más predominantes en pacientes con fibrosis quística. Por lo general, las infecciones por P. aeruginosa pueden clasificarse en agudas y crónicas, pero esta clasificación no siempre es obvia. Las infecciones agudas son frecuentes durante las primeras etapas de la infección y se asocian con un estilo de vida planctónico y con altos niveles de producción de factores de virulencia (FV). Por el contrario, las infecciones crónicas se caracterizan por una menor producción de FV y por la formación de biopelículas y células persitentes que confieren una alta resistencia a los antibióticos. El desarrollo de la infección y la transición entre infecciones agudas y crónicas están regulados por un sistema de comunicación bacteriano llamado sistema Quorum Sensing (QS), el cual controla la expresión genética en respuesta a la presencia de pequeñas moléculas señalizadoras llamadas autoinductores. Por ello, el sistema QS suscita gran interés en el desarrollo de herramientas tanto de diagnostico como de terapia.

A pesar de tratarse de una técnica larga que retrasa la administración del tratamiento con las consecuencias que esto conlleva, el cultivo en placa sigue siendo la técnica por excelencia utilizada para la detección de P. aeruginosa. Por esta razón, existe una clara necesidad de obtener técnicas de diagnóstico rápidas y sensibles. En este contexto, se ha desarrollado un ensayo inmunoquímico de alta sensibilidad, especificidad y rapidez para detectar uno de los principales FV de P. aeruginosa, la piocianina (PYO), en menos de 2 h utilizando un anticuerpo monoclonal (mAb). El bajo límite de detección del ensayo ha permitido la detección de PYO en aislados bacterianos de pacientes infectados con P. aeruginosa y su validación como potencial biomarcador de este tipo de infecciones. A la luz de los resultados obtenidos, se llevaron a cabo experimentos analizando directamente muestras clínicas como esputos e hisopos de pacientes

infectados con este patógeno. Además, basándonos en el sistema QS y en el uso de mAbs específicos contra moléculas clave de este sistema, se ha estudiado un nuevo enfoque terapéutico para tratar las infecciones causadas por P. aeruginosa. Así pues, la capacidad protectora del mAbPYO se evaluó utilizando un sistema in vitro basado en cultivo celular. Primero, se estudio el efecto citotóxico de la PYO en macrófagos murinos estudiando diferentes características de viabilidad debido a la gran cantidad de efectos tóxicos que ejerce este FV en las células huésped. Posteriormente, se ha analizado el efecto protector del mAbPYO sobre la misma línea celular obteniendo elevados porcentajes de viabilidad (50 - 80 %). Además de estudiar una molécula efectora, también se ha abordado el bloqueo de una molécula de señalización como la Pseudomonas Quinolone Signal (PQS) utilizando el mismo sistema in vitro. En este caso, los niveles de protección obtenidos han sido aún mejores alcanzando niveles de viabilidad del 80 - 100 %. Por lo tanto, los resultados obtenidos han demostrado el potencial de estos mAbs como agentes terapéuticos.