Computational and biophysical approaches for the discovery of Tribbles pseudokinases modulators

Abstract

Tribbles (TRIB) homologues proteins are a family of three pseudokinases withan important role in controlling immunity, metabolism, and cancer throughprotein-protein interactions (PPIs). TRIB pseudokinases have the same overalltertiary structure as the eukaryotic protein kinase domain but lack some of themain motifs needed for its catalytic function, such as the DFG motif and amodified glycine-rich loop. This is why this family of proteins lacks catalyticfunction and has been shown to function as scaffolds. TRIB can interact withkinases (e.g., AKT), E3 ligases (e.g., COP1, SIAH1), and even transcriptionfactors (e.g., C/EBPα). Nevertheless, little is known about how TRIB caninteract and modulate other protein functions. For example, TRIB have beenseen to act as tumor-suppressors or oncogenes in colorectal cancer in a context-dependent manner. This highlights the need of studying TRIB function in away that provides temporal and spatial control, such as a chemical probe. Asmall molecule targeting TRIB will potentially modulate TRIB activity andtherefore could help to better understand their role. Moreover, the compoundcould serve as a potential starting point for drug discovery.

Therefore, this PhD thesis aims to find small molecules that could regulateTRIB function and help to better understand this specific family of pseudoki-nases. To date, only TRIB2 has been targeted with a covalent compound prob-ing an effect of destabilization and subsequent degradation. In contrast, TRIB1is unable to interact with ATP but could potentially bind small molecules. Inthis thesis we have applied a combination of computational and biophysicaltechniques to study TRIB1 ability to bind small molecules. Thanks to thesefindings, we demonstrate that TRIB1 can bind small molecules in a similarway to canonical kinases.

At the same time, we wanted to look in more detail some of the PPIsreported for TRIB. As described before, TRIB can interact with kinases, suchas AKT/PKB which is a critical regulator of cell survival and proliferation.TRIB3 was described to regulate AKT phosphorylation in the liver, althoughthe mechanism is still poorly understood. Another case under study has beenTRIB3 and SIAH1, an E3 ligase linked to ubiquitylation and degradation ofTRIB3. The interaction of SIAH1 with TRIB3 has been already described,however, the specific mechanism of how these two proteins interact remainsunknown. In this thesis, we have been interested on elucidate these PPIs sincethey are very relevant for understanding how TRIB functions.

Las proteínas homólogas de Tribbles (TRIB) son una familia de tres pseudoquinasas con un papel importante en el control de la inmunidad, el metabolismo y el cáncer a través de interacciones proteína-proteína (PPI). Las pseudoquinasas TRIB tienen la misma estructura terciaria general que el dominio de proteína quinasa eucariota, pero carecen de algunos de los motivos principales necesarios para su función catalítica, como el motivo DFG y un bucle rico en glicina modificado. Es por esto que esta familia de proteínas carece de función catalítica y se ha demostrado que funcionan como andamios. TRIB puede interactuar con quinasas (p. ej., AKT), ligasas E3 (p. ej., COP1, SIAH1) e incluso factores de transcripción (p. ej., C/EBPα). Sin embargo, poco se sabe acerca de cómo TRIB puede interactuar y modular otras funciones de proteínas. Por ejemplo, se ha visto que TRIB actúa como supresor de tumores u oncogenes en el cáncer colorrectal de una manera dependiente del contexto. Esto destaca la necesidad de estudiar la función TRIB de manera que proporcione control temporal y espacial, como una sonda química. Una pequeña molécula dirigida a TRIB modulará potencialmente la actividad de TRIB y, por lo tanto, podría ayudar a comprender mejor su función. Además, el compuesto podría servir como un posible punto de partida para el descubrimiento de fármacos. Por lo tanto, esta tesis doctoral tiene como objetivo encontrar pequeñas moléculas que puedan regular la función TRIB y ayudar a comprender mejor esta familia específica de pseudoquinasas. Hasta la fecha, solo TRIB2 ha sido objeto de un compuesto covalente que prueba un efecto de desestabilización y posterior degradación. Por el contrario, TRIB1 no puede interactuar con ATP, pero podría unirse potencialmente a moléculas pequeñas. En esta tesis hemos aplicado una combinación de técnicas computacionales y biofísicas para estudiar la capacidad de TRIB1 para unirse a moléculas pequeñas. Gracias a estos hallazgos, demostramos que TRIB1 puede unirse a moléculas pequeñas de manera similar a las quinasas canónicas. Al mismo tiempo, queríamos ver con más detalle algunos de los PPI informados para TRIB. Como se describió anteriormente, TRIB puede interactuar con quinasas, como AKT/PKB, que es un regulador crítico de la supervivencia y proliferación celular. Se describió que TRIB3 regula la fosforilación de AKT en el hígado, aunque el mecanismo aún no se conoce bien. Otro caso en estudio ha sido TRIB3 y SIAH1, una ligasa E3 ligada a la ubiquitilación y degradación de TRIB3. La interacción de SIAH1 con TRIB3 ya ha sido descrita, sin embargo, se desconoce el mecanismo específico de interacción de estas dos proteínas. En esta tesis nos ha interesado dilucidar estos IPP ya que son muy relevantes para entender cómo funciona el TRIB.