Genetic characterization of the Japanese plum LG3-MYB10 region and development of molecular markers for fruit color

Abstract

La prunera japonesa (P. salicina i híbrids) és un arbre fruiter altament heterozigot originat a partir de la hibridació interespecífica de més d’onze espècies diploides de pruna. Aquest esdeveniment explicaria que, dintre de la família de les Rosàcies, és un dels cultius amb més variabilitat en el color dels seus fruits. Malgrat la importància dels seus fruits en el mercat, la millora assistida per marcadors en prunera japonesa està encara en fase inicial. Això s’aplica al color del fruit, que té influència en l’acceptació del consumidor i, en conseqüència, és un dels objectius clau de millora. Les tonalitats del vermell al negre es deuen a l’acumulació d’antocians, pigments sintetitzats des de la ruta dels flavonoides que tenen propietats nutracèutiques. Els gens MYB10 són candidats per la seva acumulació en els òrgans de les plantes, i QTLs pel color de fruit en Prunus s’han mapat en el grup de lligament 3 (LG3) en una regió que conté tres còpies gèniques en presseguer: PpMYB10.1, PpMYB10.2 i PpMYB10.3. L’objectiu d’aquesta tesis és estudiar el rol dels gens LG3-MYB10 en la regulació del color en fruits de prunera japonesa i proporcionar marcadors molecular eficients per la seva millora assistida per marcadors. Per estudiar la variabilitat al·lèlica dels gens LG3-MYB10 (PsMYB10) en prunera japonesa, vàrem fer servir un conjunt d’encebadors dissenyats en llocs conservats dels gens PpMYB10 de presseguer fent servir el seu genoma (Capítol 1). Vàrem trobar un al·lel (a356) altament associat al color de pell, però cap per la carn. A partir de la segregació i clonatge dels al·lels, vam poder assignar-los a haplotips i identificar una triplicació del gen PsMYB10.1 (Capítol 2). L’al·lel a356 era homòleg del PpMYB10.1 i el a470 segregava com alternatiu, recessiu pel locus (PsMYB10.1a). Per seqüenciar la regió LG3-MYB10 vàrem fer servir una tecnologia recent per la seqüenciació de regions concretes del genoma amb lectures llargues: L’enriquiment de seqüències per CRISPR-Cas9 seguit de la seqüenciació per tecnologia Oxford Nanopore (Capítol 3). Malgrat que la regió objectiu era llarga, altament variable i amb duplicacions de varis gens, amb aquesta estratègia vam podem extraure polimorfismes a partir dels alineaments amb les seqüències genòmiques de referència i l’alineament de les seqüències de novo. Tots aquests resultats van servir per trobar associació de la regió LG3-MYB10 amb el color vermell de la carn (Capítol 4), identificant un retrotransposó en el gen PsMYB10.2 correlacionat amb la seva expressió. La seva funció es va validar posant a punt un protocol per la seva sobreexpressió en fruits de prunera japonesa. Aquesta tesis proporciona: 1) marcadors moleculars eficients pel color de fruit de la pell i la carn, 2) la validació d’una estratègia per l’enriquiment de seqüències per CRISPR-Cas9 a regions altament variables amb duplicacions gèniques en un conjunt de mostres, aplicable a altres estudis a plantes i animals, i 3) un protocol per la sobreexpressió transitòria de gens en fruits de prunera japonesa, aplicable per la validació d’altres gen candidats al cultiu.

El ciruelo japonés (P. salicina e híbridos) es un árbol frutal altamente heterocigoto, originado a partir de la hibridación interespecífica de más de once especies diploides de ciruelo. Este evento explicaría que, dentro de la familia de las Rosáceas, es uno de los cultivos con más variabilidad en el color de los frutos. A pesar de la importancia de sus frutos en el mercado, la mejora asistida por marcadores en ciruelo japonés está todavía en fase inicial. Esto se aplica al color de fruto, que influye en la aceptación del consumidor y, en consecuencia, es uno de los objetivos clave de mejora. Las tonalidades del rojo al negro son debidas a la acumulación de antocianos, pigmentos sintetizados desde la ruta de los flavonoides que tienen propiedades nutracéuticas. Los genes MYB10 son candidatos para su acumulación en los órganos de las plantas, y QTLs para el color de fruto en Prunus se han mapeado en el grupo de ligamiento 3 (LG3) en una región que contiene tres copias génicas en melocotonero: PpMYB10.1, PpMYB10.2 y PpMYB10.3. El objetivo de esta tesis es estudiar el rol de los genes LG3-MYB10 en la regulación del color de fruto del ciruelo japonés y proporcionar marcadores moleculares eficientes para su mejora asistida por marcadores. Para estudiar la variabilidad alélica de los genes LG3-MYB10 (PsMYB10) en ciruelo japonés, usamos un conjunto de cebadores diseñados en sitios conservados de los genes PpMYB10 de melocotonero usando su genoma (Capítulo 1). Encontramos un alelo (a356) altamente asociado con el color de la piel, pero ninguno para la carne. A partir de la segregación y clonaje de los alelos, pudimos asignarlos en haplotipos e identificar una triplicación del gen PsMYB10.1 (Capítulo 2). El alelo a356 era homólogo del PpMYB10.1 y el a470 segregaba como alternativo, recesivo para el locus (PsMYB10.1a). Para secuenciar la región LG3-PsMYB10 usamos una reciente tecnología para la secuenciación de regiones concretas de genoma con lecturas largas: el enriquecimiento de secuencias por CRISPR-Cas9 seguido de la secuenciación con tecnología Oxford Nanopore (Capítulo 3). A pesar que la región objetivo era larga, altamente variable y con duplicaciones de varios genes, la estrategia permitió extraer polimorfismos a partir de los alineamientos con las secuencias genómicas de referencia y el alineamiento de las secuencias de novo. Estos resultados sirvieron para encontrar asociación de la región LG3-MYB10 con el color rojo de la carne (Capítulo 4), identificando un retrotransposón en el gen PsMYB10.2 correlacionado con su expresión. Su función se validó poniendo a punto un protocolo para su sobreexpresión en ciruelas japonesas. Esta tesis proporciona: 1) marcadores moleculares eficientes para el color de fruto en la piel y carne, 2) la validación de una estrategia para el enriquecimiento de secuencias por CRISPR-Cas9 en regiones altamente variables con duplicaciones génicas en un conjunto de muestras, aplicable a otros estudios en plantas y animales, y 3) un protocolo para la sobreexpresión transitoria de genes en frutos de ciruelo japonés, aplicable para la validación de otros genes candidatos en el cultivo.

Japanese plum (P. salicina and its hybrids) is a highly heterozygous fruit tree originated by the interspecific hybridization of more than eleven diploid plum species. This event might explain that, within the Rosaceae family, it is one of the crops with the widest fruit color variability. Despite the economic importance of Japanese plum fruits in the fresh market, its marker-assisted breeding is still in its infancy. This applies for the fruit color trait, which influences the consumer acceptance and, consequently, is included within the key breeding objectives. The red to black hues are caused by the accumulation of anthocyanins, pigments synthesized from the flavonoid pathway that have nutraceutical properties. The MYB10 genes are candidates for anthocyanin accumulation in plant organs, and QTLs for red fruit color in Prunus have been mapped in linkage group 3 (LG3) in a region containing three gene copies in peach: PpMYB10.1, PpMYB10.2 and PpMYB10.3. The objective of this thesis is to study the role of the LG3-MYB10 genes in the regulation of fruit color in Japanese plum and provide efficient molecular markers for marker-assisted breeding. To study the allelic variability of the Japanese plum LG3-MYB10 genes (PsMYB10), we used a set of primers designed in conserved sites of the peach PpMYB10 genes by using its genome assembly (Chapter 1). We found one allele (a356) highly associated with the fruit skin color, but none for the flesh. By means of progeny segregation and allele cloning we assigned the alleles into haplotypes and identified a PsMYB10.1 triplication (Chapter 2). Allele a356 was a PpMYB10.1 homolog, with allele a470 segregating as an alternative allele, recessive for the locus (PsMYB10.1a). To sequence the LG3-PsMYB10 region, we used a novel long-read targeted sequencing technology, the CRISPR-Cas9 enrichment followed by Oxford Nanopore Technology sequencing (Chapter 3). Despite the target region was large, highly variable and with several duplicated genes, with our strategy we could extract polymorphisms from the genome alignments against reference genomes and from de novo aligned sequences. All these previous results served to find association of the LG3-MYB10 region with the red flesh color (Chapter 4), identifying a retrotransposon in the PsMYB10.2 gene correlating with its expression. The gene function was validated by setting up a protocol for its transient overexpression in Japanese plum fruits. The main outputs of this thesis are 1) the development of efficient molecular markers for the fruit skin and flesh colors, 2) the validation of a strategy for the CRISPR-Cas9 enrichment of large and highly variable regions with gene duplications in a pool of samples, applicable in other plant and animal studies, and 3) a protocol for the transient gene overexpression in Japanese plum fruits, applicable for the validation of other candidate genes in the crop.