Relevancia de los antioxidantes en la regulación de las especies reactivas de oxígeno (ROS) en el semen de burro y caballo

Abstract

El semen constitueix un complex sistema oxidant/antioxidant a causa d’una acció prooxidant dels espermatozoides per la producció d’espècies reactives d’oxigen (ROS) derivada del metabolisme espermàtic i una acció antioxidant del plasma seminal pels seus components enzimàtics i no enzimàtics. Quan la producció de ROS excedeix la capacitat de defensa antioxidant, es genera un desequilibri que condueix a estrès oxidatiu, provocant greus alteracions estructurals i funcionals a l’espermatozoide. Si bé les ROS són importants durant la fecundació, la producció exacerbada després de l’entrada del semen a l’úter, a causa de la NETosi dels neutròfils polimorfonuclears (PMN) que actuen per combatre la reacció endometrial, influeixen en l’èxit reproductiu dels èquids. Aquesta situació s’evidencia més amb l’ús de semen criopreservat, ja que els espermatozoides perden el suport antioxidant del plasma seminal abans de la congelació, augmentant-ne la susceptibilitat a l’atac de les ROS. Per tant, l’objectiu principal d’aquesta Tesi Doctoral va ser determinar la rellevància dels antioxidants en la regulació de les ROS al semen de ruc i cavall. En el primer estudi, es va determinar la quantitat de ROS extracel·lular produïda pels espermatozoides de ruc sotmesos a estrès reductiu, estrès oxidatiu i NETosi. Es va evidenciar que les concentracions altes (≥8 mM) de glutatió reduït (GSH) generen més quantitat de ROS que les concentracions altes (fins a 10 mM) de peròxid d’hidrogen (H2O2). Això ressalta la gran resistència dels espermatozoides de ruc a la toxicitat del GSH, així com la seva gran capacitat antioxidant. A més, es va observar que la NETosi dels PMN genera una gran quantitat de ROS, que augmenta quan els PMN entren en contacte amb els espermatozoides i en absència de plasma seminal. Al segon estudi, es va l’efecte de la suplementació del medi de congelació amb diferents concentracions de GSH en la criotolerància dels espermatozoides de ruc. Es va observar que les concentracions de GSH (entre 2 mM i 10 mM) no van afectar la viabilitat, la integritat de la membrana plasmàtica i de l’acrosoma, i el potencial de membrana mitocondrial dels espermatozoides post-descongelació, mentre que la motilitat va disminuir en dosi ≥8 mM. Això va demostrar la sorprenent resistència dels espermatozoides cripreservats de ruc a dosis altes de GSH. A més, els nivells intracel·lulars de ROS post-descongelació es van reduir significativament amb concentracions altes de GSH (8 mM i 10 mM). Al tercer i quart estudi, es va investigar la relació entre la criotolerància dels espermatozoides de ruc i cavall i els antioxidants enzimàtics i no enzimàtics, i l’índex d’estrès oxidatiu (OSI) del plasma seminal. Es va observar que els nivells d’activitat de la paraoxonasa tipus 1 (PON1), de la superòxid dismutasa (SOD), i de capacitat antioxidant equivalent de Trolox (TEAC) van ser significativament superiors als ejaculats de “bona congelabilitat” que als de “ mala congelabilitat”. A més, es van trobar correlacions positives amb alguns paràmetres de motilitat i funcionalitat espermàtica post-descongelació. A més, l’OSI del plasma seminal va ser més baix en els ejaculats de “bona congelabilitat” que en els de “mala congelabilitat”, sent més gran en el cavall que en el ruc. En conclusió, aquesta Tesi Doctoral suggereix que la regulació de les ROS per part del sistema de defensa antioxidant, fonamentalment del plasma seminal, constitueix un mecanisme molt complex. En efecte, tant les característiques estructurals i funcionals dels espermatozoides com els nivells d’activitat dels antioxidants enzimàtics i no enzimàtics presents al plasma seminal, fa que el control de l’estrès oxidatiu sigui particularment específic al ruc i al cavall, la qual cosa està relacionada amb l’estratègia reproductiva de cada espècie.

El semen constituye un complejo sistema oxidante/antioxidante debido a una acción prooxidante de los espermatozoides por la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) derivada del metabolismo espermático y una acción antioxidante del plasma seminal por sus componentes enzimáticos y no enzimáticos. Cuando la producción de ROS excede la capacidad de defensa antioxidante, se genera un desequilibrio que conduce a estrés oxidativo, provocando graves alteraciones estructurales y funcionales en el espermatozoide. Si bien las ROS son importantes durante la fecundación, la producción exacerbada de éstas después de la entrada del semen al útero, debido a la NETosis de los neutrófilos polimorfonucleares (PMN) que actúan para combatir la reacción endometrial, influyen en el éxito reproductivo de los équidos. Esta situación se evidencia más con el uso de semen criopreservado, ya que los espermatozoides pierden el soporte antioxidante del plasma seminal antes de la congelación, aumentando su susceptibilidad al ataque de las ROS. Por lo tanto, el objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue determinar la relevancia de los antioxidantes en la regulación de las ROS en el semen de burro y caballo. En el primer estudio, se determinó la cantidad de ROS extracelular producida por los espermatozoides de burro sometidos a estrés reductivo, estrés oxidativo y NETosis. Se evidenció que las concentraciones altas (≥8 mM) de glutatión reducido (GSH) generan más cantidad de ROS que las concentraciones altas (hasta 10 mM) de peróxido de hidrógeno (H2O2). Esto resalta la gran resistencia de los espermatozoides de burro a la toxicidad del GSH, así como su gran capacidad antioxidante. Además, se observó que la NETosis de los PMN genera una gran cantidad de ROS, que aumenta cuando los PMN entran en contacto con los espermatozoides y en ausencia de plasma seminal. En el segundo estudio, se evaluó la suplementación de GSH al medio de congelación y su efecto sobre la criotolerancia de los espermatozoides de burro. Se observó que las concentraciones de GSH (entre 2 mM y 10 mM) no afectaron la viabilidad, la integridad de la membrana plasmática y del acrosoma, y el potencial de membrana mitocondrial de los espermatozoides post-descongelación, mientras que la motilidad disminuyó en dosis ≥8 mM. Esto demostró la sorprendente resistencia de los espermatozoides cripreservados de burro a dosis altas de GSH. Además, los niveles intracelulares de ROS post-descongelación se redujeron significativamente con concentraciones altas de GSH (8 mM y 10 mM). En el tercer y cuarto estudio, se investigó la relación entre la criotolerancia de los espermatozoides de burro y caballo y los antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos, y el índice de estrés oxidativo (OSI) del plasma seminal. Se observó que los niveles de actividad de la paraoxonasa tipo 1 (PON1), de la superóxido dismutasa (SOD), y de capacidad antioxidante equivalente de Trolox (TEAC) fueron significativamente superiores en los eyaculados de “buena congelabilidad” que en los de “mala congelabilidad”. Además, se encontraron correlaciones positivas con algunos parámetros de motilidad y funcionalidad espermática post-descongelación. Además el OSI del plasma seminal fue más bajo en los eyaculados de “buena congelabilidad” que en los de “mala congelabilidad”, siendo mayor en el caballo que en el burro. En conclusión, esta Tesis Doctoral sugiere que la regulación de las ROS por parte del sistema de defensa antioxidante, fundamentalmente del plasma seminal, constituye un mecanismo muy complejo. En efecto, tanto las características estructurales y funcionales de los espermatozoides, como los niveles de actividad de los antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos presentes en el plasma seminal, hacen que el control del estrés oxidativo sea particularmente específico en el burro y en el caballo, lo cual está relacionado con la estrategia reproductiva de cada especie.

In semen, there is a complex oxidant/antioxidant system, as the prooxidant activity from sperm via the production of reactive oxygen species (ROS) derived from their metabolism is combined with the antioxidant action by the seminal plasma through its enzymatic and non-enzymatic components. When ROS production exceeds the antioxidant defense capacity, however, an imbalance is generated, thereby leading to oxidative stress, which causes serious structural and functional alterations on sperm. While ROS play an important role related to fertilization, their exacerbated production after semen enters the uterus, which results from the NETosis of polymorphonuclear neutrophils (PMN) triggered to neutralize the endometrial reaction, influences the reproductive success in equids. This situation even becomes more apparent with the use of cryopreserved semen, because sperm lose the antioxidant support of the seminal plasma before freezing, increasing their susceptibility to ROS attack. The main objective of this Dissertation, therefore, was to determine the relevance of antioxidants in the regulation of ROS in donkey and horse semen. In the first study, the amount of extracellular ROS produced by donkey sperm subjected to reductive stress, oxidative stress and NETosis was determined. It was shown that high concentrations (≥8 mM) of reduced glutathione (GSH) generate more ROS than high concentrations (up to 10 mM) of hydrogen peroxide (H2O2), This highlights the great resilience of donkey sperm to GSH toxicity and the larger antioxidant defense capacity. In addition, NETosis of PMN was observed to generate a great amount of extracellular ROS, which increased when PMN came into contact with sperm and in the absence of seminal plasma. In the second study, how the addition of different GSH concentrations to the freezing medium affects donkey sperm cryotolerance was evaluated. Whereas GSH concentrations (between 2 mM and 10 mM) did not affect viability, plasma membrane and acrosome integrity, and mitochondrial membrane potential of sperm after thawing, motility only decreased in doses ≥8mM. This highlights the surprising resilience of crypreserved donkey sperm to high GSH doses. In addition, intracellular ROS levels after thawing significantly decreased with high GSH concentrations (8 mM and 10 mM). In the third and fourth studies, the relationship of donkey and horse sperm cryotolerance with enzymatic and non-enzymatic antioxidants, and the oxidative stress index (OSI) of seminal plasma was investigated. Activity levels of paraoxonase type 1 (PON1), superoxide dismutase (SOD), and Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) were found to be significantly higher in “good freezability” than in those “poor freezability” ejaculates. In addition, positive correlations were seen with some motility and functionality parameters after thawing. Furthermore, the OSI of seminal plasma was lower in “good freezability” than in “poor freezability” ejaculates, and was higher in the horse than in the donkey. In conclusion, this Dissertation shows that the regulation of ROS by the antioxidant defense system, largely from the seminal plasma, is a very complex mechanism. Indeed, both structural and functional characteristics of sperm and activity levels of the enzymatic and non-enzymatic antioxidants present in seminal plasma make the control of oxidative stress particularly specific in donkeys and horses, which is likely to be related to the reproductive strategy of each species.