Development of novel multimodal light-sheet fluorescence microscopes for in-vivo imaging of vertebrate organisms

Abstract

The observation of biological processes in their native environments is of critical importance for life science. While substantial information can be derived from the examination of in-vitro biological samples, in-vivo studies are necessary to reveal the complexity of the dynamics happening in real-time within a living organism. Between the possible biological model choices, vertebrates represent an important family due to the various characteristics they share with the human organism. The development of an embryo, the effect of a drug, the interaction between the immune system and pathogens, and the cellular machinery activities are all examples of highly-relevant applications requiring in-vivo observations on broadly used vertebrate models such as the zebrafish and the mouse. To perform such observations, appropriate devices have been devised. Fluorescence microscopy is one of the main approaches through which specific sample structures can be detected and registered in high-contrast images. Through micro-injections or transgenic lines, a living specimen can express fluorescence and can be imaged through such microscopes. Various fluorescence microscopy techniques have been developed, such as Widefield Microscopy (WM) and Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM). In WM the entire sample is visualized in a single 2D image, therefore losing the depth information, while LSCM can recover the 3D information of the sample but with inherent limitations, such as phototoxicity and limited imaging speed. In the last two decades, Light-Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM) emerged as a technique providing fast and 3D imaging, while minimizing collateral damages to the specimen. However, due to the particular configuration of the microscope’s components, LSFM setups are normally optimized for a single application. Also, sample management is not trivial, as controlling the specimen positioning and keeping it alive for a long time within the microscope needs dedicated environmental conditioning. In this thesis, I aimed at advancing the imaging flexibility of LSFM, with particular attention to sample management. The conjugation of these aspects enabled novel observations and applications on living vertebrate samples. In Chapter 1, a brief review of the concepts employed within this thesis is presented, also pointing to the main challenges that the thesis aims to solve. In Chapter 2, a new design for multimodal LSFM is presented, which enables performing different experiments with the same instrument. Particularly, high-throughput studies would benefit from this imaging paradigm, conjugating the need for fast and reproducible mounting of multiple samples with the opportunity to image them in 3D. Additionally, from this design, a transportable setup has also been implemented. With these systems, I studied the dynamics of the yolk’s microtubule network of zebrafish embryos, describing novel features and underlining the importance of live imaging to have a whole view of the sample’s peculiarities. This is described in Chapter 3. Further applications on challenging live samples have been implemented, monitoring the macrophage recruitment in zebrafish and the development of mouse embryos. For these applications, described in Chapter 4, I devised specific mounting protocols for the samples, keeping them alive during the imaging sessions. In Chapter 5, an additional LSFM system is described, which allows for recording the sub-cellular machinery in a living vertebrate sample, while avoiding its damage thanks to the devised sample mounting. Through this, single-molecule microscopy (SMM) studies, normally performed on cultured cells, can be extended to the nuclei of living zebrafish embryos, which better recapitulate the native environment where biological processes take place. Finally, Chapter 6 recapitulates the conclusions, the impacts, future integrations, and experimental procedures that would be enabled by the work resumed in this thesis.

La observación de los procesos biológicos en su entorno es de vital importancia para las ciencias de la vida. Si bien se puede derivar información sustancial desde muestras biológicas in-vitro, los estudios in-vivo son necesarios para revelar la complejidad de la dinámica que ocurre, en tiempo real, dentro de un organismo vivo. Entre las posibles elecciones de modelos biológicos, los vertebrados representan una familia importante debido a las diversas características que comparten con el organismo humano. El desarrollo de un embrión, la interacción entre el sistema inmunitario y los patógenos, el efecto de un fármaco y las actividades celulares son ejemplos de aplicaciones que requieren observaciones in-vivo en modelos de vertebrados, como el pez cebra y el ratón. La microscopía de fluorescencia es uno de los principales métodos mediante los cuales se pueden grabar imágenes, de alto contraste, de estructuras biológicas específicas. Utilizando microinyecciones o líneas transgénicas, es posible inducir una expresión de proteínas fluorescentes en la muestra y entonces puede ser observada a través de dichos microscopios. Existen varias técnicas de microscopía de fluorescencia, entre ellas las más utilizadas son la microscopía ¿widefield¿ (WM) y la microscopía ¿confocal¿ (LSCM). En WM, una sola imagen en 2D representa el volumen entero de la muestra, por lo cual la información de profundidad se pierde. Por otro lado, LSCM puede recuperar la información en 3D con algunas limitaciones como la fototoxicidad y una velocidad de generación de las imágenes limitada. En las últimas dos décadas, la microscopía de fluorescencia de hoja de luz (LSFM) surgió como técnica que ofrece imágenes de manera rápidas y en 3D, y que al mismo tiempo minimiza los daños colaterales de la muestra. Sin embargo, debido a la geometría de los componentes del microscopio, las configuraciones de LSFM normalmente se optimizan para una sola aplicación. Además, la gestión de las muestras no es trivial, ya que controlar su posición y mantenerlas vivas durante largos periodos de tiempo dentro del microscopio requiere una atención especifica. En esta tesis, me propuse mejorar la versatilidad que LSFM puede ofrecer, con especial atención a la gestión de muestras vivas. La conjugación de estos aspectos permitió nuevas observaciones y nuevas aplicaciones en vertebrados vivos. En el Capítulo 1, se presenta un breve resumen de los conceptos empleados dentro de esta tesis, señalando también los principales desafíos que la tesis pretende resolver. En el Capítulo 2, se presenta un nuevo diseño para un LSFM multimodal, que permite realizar diferentes experimentos con el mismo instrumento. Los estudios de High-Throughput se beneficiarían de este diseño, ya que conjuga la necesidad de un montaje rápido y reproducible de varias muestras con las ventajas de LSFM. Además, a partir de este diseño, también se ha desarrollado un otro microscopio LSFM transportable. Con estos sistemas, se estudió la dinámica de la red de microtúbulos en embriones de pez cebra, describiendo características nuevas y acentuando la importancia de los experimentos in-vivo para obtener una visión completa de la muestra. Esto se describe en el Capítulo 3. Para realizar otras aplicaciones, como la observación de la dinámica de macrófagos en el pez cebra y del desarrollo de embriones de ratón, descritas en el Capítulo 4, se establecieron protocolos de montaje específicos para las muestras, manteniéndolas vivas durante las sesiones experimentales. En el Capítulo 5, se describe otro sistema LSFM, que permite extender los estudios de microscopía de moléculas individuales (SMM), normalmente realizados en cultivos de células, a núcleos de embriones de pez cebra vivos, que recrean mejor el entorno natural de los procesos biológicos. Finalmente, el Capítulo 6 recapitula las conclusiones, los impactos, las integraciones futuras y los procedimientos experimentales que serían posibilitados por el trabajo resumido en esta tesis.