Anti-inflammatory effects of Human Serum Albumin and its mechanism of action in decompensated cirrhosis

Abstract

[eng] This doctoral thesis is divided in two studies with the commune aim of elucidating the molecular mechanisms of albumin on leukocytes, in the context of advanced liver cirrhosis. The first study is focused in the molecular mechanisms by which albumin exerts its immunomodulatory properties. Human serum albumin (HSA) is an emerging treatment for preventing excessive systemic inflammation and organ failure(s) in patients with acutely decompensated (AD) cirrhosis. Administration of HSA to patients with AD cirrhosis with elevated circulating bacterial DNA rich in unmethylated cytosine- phosphate-guanine dideoxynucleotide motifs (CpG-DNA) was associated with reduced plasma cytokine concentrations. In isolated leukocytes, HSA abolished CpG-DNA– induced cytokine expression and release independently of its oncotic and scavenging properties. Similar anti-inflammatory effects were observed with recombinant human albumin. HSA exerted widespread changes on the immune cell transcriptome, specifically in genes related to cytokines and type I interferon responses. Our data revealed that HSA was taken up by leukocytes and internalized in vesicles positively stained with early endosome antigen 1 and colocalized with CpG-DNA in endosomes, where the latter binds to Toll-like receptor 9 (TLR9), its cognate receptor. Furthermore, HSA also inhibited polyinosinic: polycytidylic acid and lipopolysaccharide-induced interferon regulatory factor 3 phosphorylation and TIR domain–containing adapter- inducing interferon-β–mediated responses, which are exclusive of endosomal TLR3 and TLR4 signaling, respectively. The immunomodulatory actions of HSA did not compromise leukocyte defensive mechanisms such as phagocytosis, efferocytosis, and intracellular reactive oxygen species production. The in vitro immunomodulatory effects of HSA were confirmed in vivo in analbuminemic humanized neonatal Fc receptor transgenic mice. These findings indicate that HSA internalizes in immune cells and modulates their responses through interaction with endosomal TLR signaling, thus providing a mechanism for the benefits of HSA infusions in patients with cirrhosis.

The second study is focused on the characterization of albumin lipidome in patients with AD as albumin has high affinity for lipids. Moreover, we explored the albumin effects on the release of fatty acid (FA)–derived lipid mediators by peripheral leukocytes. Lipids and lipid mediators were measured by liquid chromatography–tandem mass spectrometry in albumin-enriched and albumin-depleted plasma fractions separated by affinity chromatography and in leukocyte incubations from 18 patients with AD and 10 healthy subjects (HS). Lipid mediators were also measured in 41 patients with AD included in an albumin therapy trial. The plasma lipidome associated with AD cirrhosis was characterized by generalized suppression of all lipid classes except FAs. In contrast to HS, albumin from patients with AD had lower content of polyunsaturated FAs (PUFAs), especially of the omega-3- PUFA Docosahexaenoic acid. Consistent with this, the PUFA- derived lipid mediator landscape of albumin from patients with AD was dominated by lower content of monohydroxy FA precursors of anti-inflammatory/ pro-resolving lipid mediators (i.e., 15-hydroxyeicosatetraenoic acid [15-HETE]). In addition, albumin from patients with AD was depleted in prostaglandin (PG) E2, suggesting that this proinflammatory PG primarily travels disassociated to albumin in these patients. Incubation of leukocytes with exogenous albumin reduced PG production while inducing 15-lipoxygenase expression and 15-HETE release. Similar effects were seen under lipopolysaccharide plus N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine-stimulated conditions. Finally, PG levels were lower in patients with AD receiving albumin therapy, whereas 15-HETE was increased after albumin treatment compared with baseline. In conclusion, our findings indicate that the albumin lipid composition is severely disorganized in AD cirrhosis and that administration of exogenous albumin has the potential to redirect leukocyte biosynthesis from pro-inflammatory to pro-resolving lipid mediators.

[cat] Aquesta tesi esta dividida en dos estudis englobats sota l’objectiu d’elucidar els mecanismes moleculars de l’efecte de l’albúmina en leucòcits, en el context de la Cirrosis hepàtica avançada. En el primer estudi, es van estudiar els mecanismes moleculars pels quals l’albúmina exerceix les propietats immunomodulatòries. L’albúmina sèrica humana (HSA) s’utilitza com a tractament per prevenir un excés de la inflamació sistèmica i la fallada orgànica en pacients amb cirrosis descompensada (AD). L’administració de HSA en pacients amb AD cirrosis que tenien nivells circulants elevats de ADN bacterià ric en motius CpG, es va associar a una reducció de la concentració de citocines en plasma. En leucòcits aïllats, la HSA va ser capaç d’erradicar l’expressió i l’alliberament de citocines induïdes per CpG independentment de les seves propietats oncòtiques i de segrest. Es van observar efectes antiinflamatoris similars amb albúmina humana recombinant. A més, HSA provoca canvis en el transcriptoma de les cèl·lules immunes, específicament en gens relacionats amb les citocines i la resposta a interferó tipus I. Les nostres dades van revelar que els leucòcits eren capaços de captar HSA i internalitzar-la en vesícules intracel·lulars, en endosomes on HSA colocalitza amb CpG, ja que el seu receptor tipus Toll 9 (TLR9) es troba en aquestes vesícules. A més, HSA també era capaç d’inhibir les respostes inflamatòries induïdes per poly (IC) i LPS, que són exclusives de la senyalització endosomal TLR3 i TLR4, respectivament. Les accions immunomoduladores de HSA no van comprometre els mecanismes defensius dels leucòcits, com la fagocitosi, l'eferocitosi i la producció d'espècies reactives d'oxigen intracel·lular. Els efectes immunomoduladors in vitro de HSA es van confirmar in vivo en ratolins humanitzats analbuminèmics. Aquestes troballes indiquen que HSA s'internalitza a les cèl·lules immunitàries i modula les respostes a través de la interacció amb la senyalització de TLR endosomal, fet que proporciona un mecanisme per als beneficis de les infusions d'HSA en pacients amb cirrosi.

Al segon projecte, es va estudiar el lipidoma de l’albúmina en aquests pacients, ja que l'albúmina té una alta afinitat pels lípids. A més vam explorar els efectes de l'albúmina en l'alliberament de mediadors lipídics bioactius per part dels leucòcits. Els mediadors lipídics es van mesurar mitjançant cromatografia líquida unida a espectrometria de masses en tàndem en fraccions de plasma enriquides amb albúmina i empobrides en albúmina separades per cromatografia d'afinitat i en incubacions de leucòcits de 18 pacients amb cirrosi i 10 subjectes sans. El lipidoma plasmàtic associat amb la cirrosi es va caracteritzar per la supressió generalitzada de totes les classes de lípids excepte els àcids grassos (FA). A diferència del que veiem en subjectes sans (HS), l'albúmina dels pacients tenia un contingut més baix de FA poliinsaturats (PUFA), especialment

dels omega-3-PUFA. D'acord amb això, el panorama de mediadors lipídics derivats de PUFA de l'albúmina dels pacients va estar dominat per un contingut més baix de precursors de mediadors lipídics antiinflamatoris i pro-resolutius (és a dir, àcid 15- hidroxieicosatetraenoic, 15-HETE ). A més, a l'albúmina dels pacients amb AD la prostaglandina (PG) E2 es trobava en menor concentració, cosa que suggereix que aquesta PG pro inflamatòria viatja principalment dissociada a l'albúmina en aquests pacients. La incubació de leucòcits amb albúmina exògena va reduir la producció de PG mentre induïa l'alliberament de 15-HETE. Finalment, els mediadors de lípids també es van mesurar en 41 pacients amb AD inclosos en un assaig clínic de teràpia amb albúmina. Els nivells de PG van ser més baixos en els pacients amb AD que van rebre tractament amb albúmina, mentre que els nivells de 15-HETE estaven augmentats després del tractament amb albúmina en comparació del valor inicial. Les nostres troballes indiquen que la composició lipídica de l'albúmina està severament desorganitzada a la cirrosi descompensada i que l'administració d'albúmina exògena té el potencial de redirigir la biosíntesi de leucòcits de mediadors lipídics pro inflamatoris a pro-resolutius.