Omics approaches for omega-6/omega-3 polyunsaturated fatty acid ratio in pigs

Abstract

En general, la qualitat de la carn està fortament influenciada per la composició dels àcids grassos (AG) i el greix intramuscular, que depèn en gran mesura de la ingesta de greix a la dieta dels porcs, però també està influenciada per variants genètiques . En aquesta tesi doctoral, dilucidem els efectes dels lípids de la dieta, en termes de la proporció d'àcids grassos poliinsaturats (AGP) omega-6 (n-6)/omega-3 (n-3), sobre la qualitat de la carn porcina i la integració de tecnologies OMICAS com la genòmica, la transcriptòmica i la proteòmica. Amb l'objectiu d'entendre com l'associació entre les ràtios n-6/n-3 AGP, l'expressió del transcriptoma porcí i els processos biològics relacionats amb el metabolisme dels AGP, fem RNA-Seq i microRNA-Seq en mostres de múscul longissimus dorsi de 20 porcs Ibèrics x Duroc amb valors extrems de la relació dels AGP n-6/n-3 i identifiquem ARN missatgers (ARNm) i microARNs (miARNs) expressats diferencialment. Les nostres troballes van destacar gens d'ARNm, miARNs i vies enriquides que estaven relacionats amb el metabolisme dels lípids, el creixement cel·lular i la inflamació, d'acord amb les diferències en la proporció d'AGP n-6/n-3 del múscul. A més, es van descobrir xarxes reguladores rellevants de miARN a ARNm (per exemple, mir-15b a ARRDC3; mir-7142-3p a METTL21C), i es van relacionar amb la lipòlisi, l'obesitat, la miogènesi i el catabolisme proteic. També es va determinar com les dietes per a truges amb proporcions altes o baixes d'AGP n-6/n-3, de 13:1 (SOY) i 4:1 (LIN), van influir en el rendiment reproductiu de les truges, en el rendiment del creixement dels garrins pre-estetats i en la deposició de greix, incloent-hi les proteïnes i els gens codificadors de proteïnes mitjançant l'anàlisi proteòmica. A les truges, LIN va reduir els garrins nascuts morts i la mortalitat predestete. Tot i que el pes dels garrins i el guany de pes van variar entre les proporcions d'AGP n-6/n-3, el pes al deslletament i el guany de pes global no es van veure afectats per les intervencions dietètiques. L'anàlisi proteòmica comparativa entre SOY i LIN, va revelar 4 i 11 proteïnes sobreabundants en els teixits muscular i adipós, respectivament. A més, el paper proinflamatori dels AGP n-6 pot estar associat a la sobreabundància observada d'haptoglobina, una proteïna de fase aguda, ia l'estimulació de gens codificadors de proteïnes i proteïnes rellevants per a la resposta immune innata i la resposta inflamatòria aguda. Utilitzant la mateixa població, apliquem l'enfocament d'anàlisi de divisió d'exó-intró (EISA) per donar compte dels canvis posttranscripcionals, impulsats per la repressió funcional putativa de miRNA, en resposta als valors extrems de la relació d'AGP n -6/n-3 al múscul longissimus dorsi en garrins mascles i femelles. L'EISA va revelar 11 i 97 gens d'ARNm dins del 5% de les puntuacions negatives del PTc amb una reducció de la regió exònica d'almenys 1,5 vegades als garrins SOY-mascle (SOY-M) i LIN-mascle (LIN) -M), respectivament. A més, els miARNs regulats a l'alça detectats albergaven llocs d'unió al 72,73% (SOY-M) i al 61,86% (LIN-M) d'aquests gens regulats a la baixa de forma posttranscripcional. No obstant això, els senyals generals de PTc a les femelles no van ser tan forts i clars com els mascles. També descobrim gens que estan predominantment associats a la modulació de les respostes immunitàries i el metabolisme dels lípids, que poden estar relacionats amb les propietats pro i antiinflamatòries dels AGP n-6 i n-3, respectivament. El nostre ús d'EISA ens va permetre identificar xarxes reguladores que van complementar les anàlisis tradicionals d'expressió diferencial i ens va proporcionar una comprensió més completa dels canvis.

En general, la calidad de la carne está fuertemente influenciada por la composición de los ácidos grasos (AG) y la grasa intramuscular, que depende en gran medida de la ingesta de grasa en la dieta de los cerdos, pero también esta influenciada por variantes genéticas. En esta tesis doctoral, dilucidamos los efectos de los lípidos de la dieta, en términos de la proporción de ácidos grasos poliinsaturados (AGP) omega-6 (n-6)/omega-3 (n-3), sobre la calidad de la carne porcina y la integración de tecnologías OMICAS como la genómica, la transcriptómica y la proteómica. Para comprender la asociación entre los ratios n-6/n-3 AGP, la expresión del transcriptoma porcino y los procesos biológicos relacionados con el metabolismo de los AGP, realizamos RNA-Seq y microRNA-Seq en muestras de músculo longissimus dorsi de 20 cerdos Ibéricos x Duroc con valores extremos de la relación de los AGP n-6/n-3 e identificamos ARN mensajeros (ARNm) y microARNs (miARNs) expresados diferencialmente. Nuestros hallazgos destacaron genes de ARNm, miARNs y vías enriquecidas que estaban relacionados con el metabolismo de los lípidos, el crecimiento celular y la inflamación, de acuerdo con las diferencias en la proporción de AGP n-6/n-3 del músculo. Además, se descubrieron redes reguladoras relevantes de miARN a ARNm (por ejemplo, mir-15b a ARRDC3; mir-7142-3p a METTL21C), y se relacionaron con la lipólisis, la obesidad, la miogénesis y el catabolismo proteico. También se determinó cómo las dietas para cerdas con proporciones altas o bajas de AGP n-6/n-3, de 13:1 (SOY) y 4:1 (LIN), influyeron en el rendimiento reproductivo de las cerdas, en el rendimiento del crecimiento de los lechones predestetados y en la deposición de grasa, incluyendo las proteínas y los genes codificadores de proteínas mediante el análisis proteómico. En las cerdas, LIN redujo los lechones nacidos muertos y la mortalidad predestete. Aunque el peso de los lechones y la ganancia de peso variaron entre las proporciones de AGP n-6/n-3, el peso al destete y la ganancia de peso global no se vieron afectados por las intervenciones dietéticas. El análisis proteómico comparativo entre SOY y LIN, reveló 4 y 11 proteínas sobreabundantes en los tejidos muscular y adiposo, respectivamente. Además, el papel proinflamatorio de los AGP n-6 puede estar asociado a la sobreabundancia observada de haptoglobina, una proteína de fase aguda, y a la estimulación de genes codificadores de proteínas y proteínas relevantes para la respuesta inmune innata y la respuesta inflamatoria aguda. Utilizando la misma población, aplicamos el enfoque de análisis de división de exón-intrón (EISA) para dar cuenta de los cambios post-transcripcionales, en respuesta a los valores extremos de la relación de AGP n-6/n-3 en el músculo longissimus dorsi en lechones machos y hembras. El EISA reveló 11 y 97 genes de ARNm dentro del 5% de las puntuaciones negativas del PTc con una reducción de la región exónica de al menos 1,5 veces en los lechones SOY-macho (SOY-M) y LIN-macho (LIN-M), respectivamente. Además, los miARNs regulados al alza detectados albergaban sitios de unión en el 72,73% (SOY-M) y en el 61,86% (LIN-M) de estos genes regulados a la baja de forma post-transcripcional. Sin embargo, las señales generales de PTc en las hembras no fueron tan fuertes y claras como las de los machos. También descubrimos genes que están predominantemente asociados en la modulación de las respuestas inmunitarias y el metabolismo de los lípidos, que pueden estar relacionados con las propiedades pro y antiinflamatorias de los AGP n-6 y n-3, respectivamente. Nuestro uso de EISA nos permitió identificar redes reguladoras que complementaron los análisis tradicionales de expresión diferencial, proporcionándonos una comprensión más completa de los cambios metabólicos del músculo en respuesta a la concentración de AGP.

In general, meat quality is heavily influenced by fatty acid (FA) composition and intramuscular fat, which is mostly dependent on the dietary fat intake of pigs, but it is also affected by genetic variants. In this PhD thesis, we elucidated the effects of dietary lipids, in terms of omega-6 (n-6)/omega-3 (n-3) polyunsaturated fatty acid (PUFA) ratio, on porcine meat quality and the integration of OMICS technologies such as genomics, transcriptomics, and proteomics. With the aim of understanding the association between n-6/n-3 PUFA ratios, porcine transcriptome expression, and biological processes related to PUFA metabolism, we performed RNA-Seq and microRNA-Seq on longissimus dorsi muscle samples from 20 Iberian x Duroc pigs with extreme values for n-6/n-3 FA ratio and identified differentially expressed messenger RNAs (mRNAs) and microRNAs (miRNAs). Our findings highlighted mRNA genes, miRNAs and enriched pathways that were related to lipid metabolism, cell growth and inflammation, according to differences in muscle n-6/n-3 PUFA ratio. Relevant miRNA-to-mRNA regulatory networks were also uncovered (i.e., mir-15b to ARRDC3; mir-7142-3p to METTL21C), and linked to lipolysis, obesity, myogenesis, and protein catabolism. We also determined on how sow diets with high or low n-6/n-3 PUFA ratios of 13:1 (SOY) and 4:1 (LIN), influenced the reproductive performance of sows, growth performance of pre-weaned piglets, and fat deposition, including proteins and protein-coding genes using proteomics analysis. In sows, LIN decreased dead-born piglets and pre-weaning mortality. Although piglet weight and weight gain varied in between n-6/n-3 PUFA ratios, weaning weight and overall weight gain were not affected by dietary interventions. Proteomic analysis revealed 4 and 11 overabundant proteins in muscle and adipose tissues, respectively, in SOY compared to LIN. Additionally, the pro-inflammatory role of n-6 PUFAs may be associated to the observed overabundance of haptoglobin, an acute-phase protein, and the stimulation of protein-coding genes and proteins relevant to the innate immune response and acute inflammatory response. Using the same population, we applied the use of exon-intron split analysis (EISA) approach to account for post-transcriptional changes, driven by putative functional miRNA repression, in response to extreme values of n-6/n-3 PUFA ratio in longissimus dorsi muscle in male and female piglets. EISA revealed 11 and 97 mRNA genes within the top 5% negative PTc scores with at least 1.5-fold exonic region reduction in SOY-male (SOY-M) and LIN-male (LIN-M) piglets, respectively. Furthermore, the detected upregulated miRNAs harbored binding sites on 72.73% (SOY-M) and 61.86% (LIN-M) of these post-transcriptionally downregulated genes. Moreover, the overall PTc signals in females were not as strong and clear as those from the males. In addition, we discovered genes that are predominantly associated in the modulation of immune responses and lipid-related metabolism, which may be related to the pro- and anti-inflammatory properties of n-6 and n-3 PUFAs, respectively. Our use of EISA enabled us to identify regulatory networks that complemented traditional analyses of differential expression, providing us a more comprehensive understanding of muscle metabolic changes in response to PUFA concentration.