Insights into MERS-CoV disease resistance in the camelid reservoir and strategies to prevent zoonotic spillover

Abstract

El coronavirus de la síndrome respiratòria de l'Orient Mitjà (MERS-CoV) continua causant brots a la península aràbiga. Els pacients greus pateixen una pneumònia que pot ser fatal, caracteritzada per una infiltració massiva de cèl·lules immunitàries als pulmons que agreugen la malaltia. Els ratpenats i els camèlids són els reservoris naturals del MERS-CoV, mentre que els dromedaris són la principal font d'infecció d'humans. Es creu que els camèlids generen una resposta immunitària oportuna per contrarestar la infecció eficaçment i prevenir el desenvolupament de malaltia respiratòria. L'epiteli nasal infectat per MERS-CoV indueix IFNs tipus I i III durant el pic de la infecció, els quals activen respostes immunitàries antivirals al llarg del tracte respiratori. Aquest treball evidencia que els macròfags alveolars dels camèlids poden ser importants per l'eliminació del MERS-CoV sense desencadenar respostes pro-inflamatòries. Fora el tracte respiratori, el MERS-CoV és transportat cap a òrgans limfoides secundaris, on no hi ha replicació viral in vitro. Els nodes limfàtics cervicals produeixen respostes immunitàries cel·lulars innates i adaptatives (p. ex., IFNs, ISGs o respostes tipus Th1) en l'exposició secundaria al MERS-CoV, però no respostes inflamatòries. Com els ratpenats, els camèlids inhibeixen la inflamació en diferents compartiments anatòmics que permeten la replicació transitòria, excreció i transmissió del MERS-CoV. A més, els dromedaris desenvolupen una immunitat adaptativa minvant que ràpidament permet la re-infecció viral. Per tant, la endemicitat del MERS-CoV en dromedaris guia l'evolució viral, mentre que els humans només són hostes terminals que pateixen la malaltia zoonòtica. Actualment, les soques del clade B circulen per Aràbia i són introduïdes a la població humana contínuament, mentre que les del clade C són àmpliament detectades en dromedaris africans. Tot i evidències serològiques i moleculars de la infecció d'humans exposats a dromedaris africans, mai s'han descrit casos de MERS zoonòtica a l'Àfrica. Hi ha un flux comercial de dromedaris des d'Àfrica cap a l'Orient Mitjà, però els virus del clade C no es troben en la darrera regió. Aquesta tesi doctoral aporta evidències experimentals de l'excreció perllongada de virus aràbics (clade B) en camèlids, en comparació amb soques africanes (clade C). La replicació i transmissió diferencial entre soques del MERS-CoV podrien explicar la dominància del clade B a l'Orient Mitjà. Remarcablement, aquest treball recomana evitar la introducció de soques del clade B a l'Àfrica, ja que podrien desplaçar les soques del clade C i incrementar l'amenaça zoonòtica en aquest continent. La vacunació del bestiar és l'estratègia recomanada per impedir la propagació del MERS-CoV entre animals reservori i la potencial transmissió a humans. Avui en dia no existeixen vacunes contra el MERS-CoV, encara que alguns prototips per ús humà s'estan avaluant en afers regulatoris. En aquest treball hem explorat la capacitat de dos prototips de vaccí per reduir la transmissió viral entre camèlids, utilitzant un escenari de contacte directe entre llames per simular la infecció natural per MERS-CoV. Els candidats vacunals s'han basat en la subunitat S1 o el domini d'unió a receptor (RBD) de la proteïna S, combinats amb un adjuvant registrat per ús animal. Ambdós prototips indueixen nivells alts d'anticossos neutralitzants contra MERS-CoV. L'RBD només va protegir una llama de tres vacunades. Contràriament, la vacunació S1 va proporcionar immunitat sistèmica i a la mucosa respiratòria, va protegir els animals contra la infecció per MERS-CoV i va impedir l'excreció de virus infecciós. Els nostres estudis evidencien que la vacunació de l'espècie reservori pot ser una solució econòmica per prevenir la transmissió zoonòtica del MERS-CoV a humans. La present tesi doctoral proporciona coneixement sobre la resistència a la malaltia causada pel MERS-CoV en camèlids reservori i proposa estratègies per prevenir la infecció zoonotica.

El coronavirus del síndrome respiratorio del Oriente Medio (MERS-CoV) continúa causando brotes en la península arábiga. Los pacientes graves sufren una neumonía que puede resultar fatal, caracterizada por una infiltración masiva de células inmunes en los pulmones que agravan la enfermedad. Los murciélagos y los camélidos son los reservorios naturales del MERS-CoV, mientras que los dromedarios son la principal fuente de infección en humanos. Se cree que los camélidos generan una respuesta inmune oportuna para contrarrestar la infección eficazmente y prevenir el desarrollo de enfermedad respiratoria. El epitelio nasal infectado por MERS-CoV induce IFNs tipo I y III durante el pico de la infección, los cuales activan respuestas inmunes antivirales a lo largo del tracto respiratorio. Este trabajo evidencia que los macrófagos alveolares de los camélidos pueden ser importantes para la eliminación del MERS-CoV sin desencadenar respuestas proinflamatorias. Fuera del tracto respiratorio, el MERS-CoV es transportado hacia órganos linfoides secundarios, dónde no hay replicación viral in vitro. Los linfonódos cervicales producen respuestas inmunes celulares innatas y adaptativas (p.ej., IFNs, ISGs o respuestas tipo Th1) ante la exposición secundaria al MERS-CoV, pero no respuestas inflamatorias. Como los murciélagos, los camélidos inhiben la inflamación en diferentes compartimentos anatómicos que permiten la replicación viral transitoria, excreción y transmisión del MERS-CoV. Además, los dromedarios desarrollan una inmunidad adaptativa menguante que permite la reinfección viral rápidamente. Por lo tanto, la endemicidad del MERS-CoV en dromedarios guía la evolución viral, mientras que los humanos solamente son huéspedes terminales que sufren enfermedad zoonótica. Actualmente, las cepas del clado B circulan por Arabia y son introducidas continuamente en la población humana, mientras que las del clado C se detectan ampliamente en dromedarios africanos. A pesar de evidencias serológicas y moleculares de la infección de humanos expuestos a dromedarios infectados, nunca se han descrito casos de MERS zoonótico en África. Existe un flujo comercial de dromedarios desde África hacía el Oriente Medio, pero los viruses del clado C no se encuentran en esta última región. La presente tesis aporta evidencias experimentales de la excreción prolongada de viruses arábigos (clado B) en comparación con cepas africanas (clado C). La replicación y transmisión diferencial entre cepas de MERS-CoV podrían explicar la dominancia del clado B en el Oriente Medio. Remarcablemente, este trabajo recomienda evitar la introducción de cepas del clado B en África, ya que podrían desplazar las cepas del e incrementar la amenaza zoonótica en el continente. La vacunación del ganado es la estrategia recomendada para impedir la propagación del MERS-CoV entre animales reservorio y la potencial transmisión a humanos. Hoy en día no existen vacunas contra el MERS-CoV, aunque algunos prototipos para uso humanos se están evaluando en vías regulatorias. En este trabajo hemos explorado la capacidad de dos prototipos vacunales para reducir la transmisión viral entre camélidos, utilizando un escenario de contacto directo entre llamas para simular la infección natural por MERS-CoV. Los candidatos vacunales se han basado en la subunidad S1 o el dominio de unión a receptor (RBD) de la proteína S, combinados con un adyuvante registrado para uso animal. Ambos prototipos inducen niveles altos de anticuerpos neutralizantes contra MERS-CoV. El RBD sólo protegió una llama de tres vacunadas. Contrariamente, la vacunación S1 proporcionó inmunidad sistémica y mucosal, protegió los animales contra la infección por MERS-CoV e impidió la excreción de virus infeccioso. Nuestros estudios evidencian que la vacunación del reservorio animal puede ser una solución económica para prevenir la transmisión zoonótica del MERS-CoV a humanos. La presente tesis doctoral proporciona conocimiento sobre la resistencia a la enfermedad causada por el MERS-CoV en camélidos reservorio y propone estrategias para prevenir la infección zoonótica.

Outbreaks caused by the Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) are ongoing in the Arabian Peninsula. Patients with severe MERS can experience fatal pulmonary disease due to a massive infiltration of immune cells into the lungs, exacerbating lung injury. Bats and camelid species are the natural reservoirs of MERS-CoV, being dromedary camels the primary source of human infection. Camelids trigger robust and timely innate immune responses thought to resolve MERS-CoV infection and prevent disease development. A high induction of type I and III IFNs by MERS-CoV-infected nasal epithelium during the peak of infection would likely activate downstream antiviral responses along the respiratory tract. Here, we evidenced that alveolar macrophages from camelids could be important mediators of MERS-CoV clearance without eliciting pro-inflammatory responses. Outside the respiratory tract, MERS-CoV is carried to secondary lymphoid organs, but viral replication does not occur in these compartments as we determined in vitro. Cervical lymph nodes induced innate and adaptive cellular immune responses (i.e., IFNs, ISGs, Th1-like responses) to a secondary MERS-CoV exposure, but not inflammatory responses. Like bats, dampened inflammation in key anatomical compartments of camelids allows transient replication, shedding and transmission of MERS-CoV while remaining asymptomatic. Moreover, field data revealed waning adaptive immunity in dromedaries, allowing for rapid MERS-CoV reinfection. Thus, endemicity of MERS-CoV in dromedary camels drives viral evolution, whereas humans are merely terminal hosts suffering from zoonotic disease. Currently, clade B strains are prevalent in the Arabian Peninsula and are being repeatedly introduced into the human population, whereas clade C strains are restricted to African dromedaries. Although MERS-CoV is widespread in the latter ones, human disease of zoonotic origin has only been reported in the Arabian Peninsula. Serological and molecular evidence of MERS-CoV infection have been found in camel handlers, but no zoonotic MERS has been reported across Africa. Despite a continuous dromedary trade from Africa to the Arabian Peninsula, African clade C viruses are not found in this region. This Ph.D. thesis provides experimental evidence for extended Arabian clade B shedding in a camelid model compared to African clade C counterparts. Increased replicative fitness and differential transmission patterns between MERS-CoV clades support the dominance of clade B strains in the Middle east. These results might explain why MERS-CoV clade C strains fail to establish in the Arabian Peninsula. Importantly, our work recommends that the introduction of clade B strains to Africa must be avoided, as they might outcompete African clade C strains and pose a greater zoonotic threat in Africa. Vaccination of livestock reservoir species is a recommended strategy to prevent spread of MERS-CoV among animals and potential spillover to humans. To date, there is a lack of commercial vaccines against MERS-CoV, although some prototypes for human use are being examinated in regulatory pathways. We explored the capacity of two different vaccine candidates to curtail MERS-CoV transmission among camelids, using a llama direct-contact transmission set up to mimic MERS-CoV natural infection. Prototypes were based in the S1 subunit or the receptor-binding domain (RBD) of the Spike protein formulated using a registered adjuvant for animal use. Both vaccine candidates induced high levels of MERS-CoV-neutralizing antibodies. RBD vaccination only provided protection in one out of three vaccinated llamas. In contrast, immunization with the S1 candidate elicited both mucosal and systemic protective immunity, conferring protection against MERS-CoV infection. This vaccine candidate completely prevented infectious viral shedding. Our data provide further evidence that vaccination of the reservoir host may be an economical solution to impede MERS-CoV zoonotic transmission to humans. The present Ph.D. thesis contributes to the understanding of disease resistance mechanisms in camelid reservoir species and propose strategies to prevent MERS-CoV spillover.