Desarrollo de nuevas herramientas en biopsia líquida aplicadas a cáncer de mama y gliomas

Abstract

El càncer de mama i els gliomes són dos dels tumors amb més impacte en la societat actual: un per ser el més prevalent i amb més incidència i l’altre per la dificultat de detecció i l’alt índex de mortalitat. Tot i els avenços en el camp de l’oncologia clínica, diagnòstic, pronòstic, monitorització i predicció de teràpia, encara queda molt camí per assolir una medicina personalitzada. L’auge de noves eines com la biòpsia líquida (BL), es presenta com una oportunitat per reforçar la detecció precoç; el seguiment de l’evolució del tumor; l’avaluació de la resposta a un tractament determinat; la detecció de mutacions accionables i el descobriment de nous biomarcadors. El gran repte de la BL és la detecció dels compostos que realment han estat alliberats pel tumor. Les tecnologies que, amb un límit de detecció suficient, permeten detectar alteracions genètiques procedents del tumor, suposen una inversió econòmica ingent per gran part dels laboratoris. En aquest sentit, les vesícules extracel·lulars (VEs) són una de les fonts de biomarcadors més investigades, ja que el seu aïllament pot augmentar la representació d’àcids nucleics procedents del tumor. Tot i això, el seu aïllament i detecció suposa d’uns requeriments tècnics no disponibles per a tots els laboratoris. En aquesta tesi presentem un protocol d’aïllament de VEs amb un rendiment superior als mètodes de referència més utilitzats. Així mateix, analitzem dos tipus de biomarcadors genètics extrets a partir de les VEs aïllades: miARN als tumors mamaris i ADN als tumors glials. De totes les molècules presents a les VEs, els miARNs són els que estan captant més interès dins de la comunitat científica. En aquesta investigació, proposem per primera vegada l’anàlisi d’expressió relativa de miARNs de VEs per a l’estratificació de la resposta a la quimioteràpia neoadjuvant en pacients amb càncer de mama d’aquells fenotips que presenten una clínica més agressiva, que els hem anomenat fenotips extrems: HER2 sobreexpressat, luminal B amb HER2 sobreexpressat i triple negatiu. També s’ofereix una alternativa cost-efectiva per a la detecció de la mutació IDH1R132H en ADN de VEs procedents pacients amb glioma. La tecnologia aquí descrita és independent tant de mètodes clàssics (seqüenciació i RT-q-PCR), com de tecnologies d’última generació (PCR digital i seqüenciació de nova generació) podent-se instaurar en qualsevol laboratori mínimament equipat. Encara més, aquesta tècnica és extensible a altres alteracions genètiques d’interès en gliomes i altres patologies.

El cáncer de mama y los gliomas son dos de los tumores con más impacto en la sociedad actual: uno por ser el más prevalente y con una mayor incidencia y el otro por su dificultad de detección y su alto índice de mortalidad. A pesar de los avances en el campo de la oncología clínica, diagnóstico, pronóstico, monitorización y predicción de terapia, aún queda mucho camino para alcanzar una medicina personalizada. El auge de nuevas herramientas como la biopsia líquida (BL), se presenta como una oportunidad para reforzar la detección precoz; el seguimiento de la evolución del tumor; la evaluación de la respuesta a un determinado tratamiento; la detección de mutaciones accionables y el descubrimiento de nuevos biomarcadores. El gran reto de la BL es la detección de aquellos compuestos que realmente han sido liberados por el tumor. Las tecnologías que, con un límite de detección suficiente, permiten hallar alteraciones genéticas procedentes del tumor, suponen una inversión económica ingente por parte de los laboratorios. En este sentido, las vesículas extracelulares (VEs) son una de las fuentes de biomarcadores más investigadas, ya que su aislamiento puede aumentar la representación de ácidos nucleicos procedentes del tumor. Sin embargo, su aislamiento y detección, supone de unos requerimientos técnicos no disponibles para todos los laboratorios. En esta tesis presentamos un protocolo de aislamiento de VEs con un rendimiento superior a los métodos de referencia más usados. Asimismo, analizamos dos tipos de biomarcadores genéticos extraídos a partir de las VEs: miARN en los tumores mamarios y ADN en los tumores gliales. De todas las moléculas presentes en las VEs, los miARNs son los que están captando mayor interés dentro de la comunidad científica. En esta investigación, proponemos por primera vez el análisis de expresión relativa de miARNs en VEs para la estratificación de la respuesta a la quimioterapia neoadyuvante en pacientes con cáncer de mama con fenotipos que presentan una clínica más agresiva, que denominamos fenotipos extremos: HER2 sobreexpresado, luminal B con HER2 sobreexpresado y triple negativo. También se ofrece una alternativa coste-efectiva en cuanto a la detección de la mutación IDH1R132H en ADN de VEs procedentes de pacientes con glioma. La tecnología aquí descrita es independiente tanto de métodos clásicos (secuenciación y RT-q-PCR), como de tecnologías de última generación (PCR digital y secuenciación de nueva generación), pudiéndose instaurar en cualquier laboratorio mínimamente equipado. Más aún, esta técnica es extensible a otras alteraciones genéticas de interés en gliomas y otras patologías.

Breast cancer and gliomas are two of the tumors with the greatest impact on today’s society. Breast cancer is the most prevalent tumor and has the highest incidence, and gliomas for its difficulty in detection and its high mortality rate. Despite advances in the field of clinical oncology, diagnosis, prognosis, monitoring and therapy prediction, there is still a long way to go to achieve personalized medicine. The rise of new tools such as liquid biopsy (LB), is presented as an opportunity to reinforce early detection; monitoring of tumor evolution; the evaluation of the response to a treatment; the detection of actionable mutation changes and the discovery of new biomarkers. The great challenge of LB is the detection of those compounds that have truly been released by the tumor. The technologies that, with a sufficient detection limit, make it possible to find genetic alterations derived from the tumour, represent a huge economic investment by laboratories. In this way, extracellular vesicles (EVs) are one of the most investigated sources of biomarkers since their isolation can increase the representation of tumor nucleic acids. However, its isolation and detection entail technical requirements that are not available to all laboratories. In this thesis we present a protocol for isolating EVs with a higher yield than the most used reference methods. We also analysed two types of genetic biomarkers extracted from isolated EVs: miRNA in breast tumors and DNA in glioma. Out of all the molecules contained in the EVs, miRNAs are the ones that are attracting the most interest within the scientific community. Here, we propose for the first time the analysis of relative expression of miRNAs in VEs for the stratification of response to neoadjuvant chemotherapy in patients with most aggressive breast cancer types: HER2 overexpressed, luminal B with HER2 overexpressed and triple negative. Which we call them extreme phenotypes. In addition, we present a cost-effective alternative for the detection of the IDH1R132H mutation in DNA from EVs from glioma patients. The technology described here is independent of both classical methods (sequencing and RT-q-PCR) and cutting-edge technologies (digital PCR and next-generation sequencing), so it can be installed in any minimally equipped laboratory.