A novel neuroprotective therapy for acute ischemic stroke: preclinical evidence of remote ischemic conditioning

Abstract

L'ictus isquèmic és una de les principals causes de morbiditat i mortalitat en persones adultes a tot el món. Les principals teràpies de revascularització són la trombòlisi endovenosa i la trombectomia mecànica. Malauradament, molts pacients no poden beneficiar-se d'aquestes teràpies a causa d'una finestra terapèutica estreta o de contraindicacions mèdiques. Les teràpies neuroprotectores tenen un gran potencial no només per augmentar els beneficis de les teràpies de reperfusió disponibles, sinó també per proporcionar un procediment mèdic aconsellable per als pacients amb ictus que no poden rebre els tractaments actuals. Un enfocament terapèutic prometedor és el condicionament isquèmic remot (CIR). El CIR consisteix en episodis breus d’isquèmia-reperfusió en un òrgan llunyà, com l'extremitat, que poden proporcionar protecció al cervell isquèmic. Els efectes protectors del CIR poden estar mediats per mecanismes cel·lulars que contraresten nombrosos aspectes de la patogènesi de l'ictus. No obstant, els mecanismes subjacents específics que contribueixen al CIR són complexos i poc coneguts.

En aquesta tesi doctoral, vam plantejar la hipòtesi que l'efecte neuroprotector induït pel PerCIR (durant la isquèmia) i PostCIR (després de la isquèmia) en la isquèmia cerebral pot estar associat a un patró cel·lular específic, a la regulació de la resposta inflamatòria i a canvis en el perfil metabolòmic cerebral. Per tant, l'objectiu d'aquest estudi és avaluar els efectes neuroprotectors del PerCIR i PostCIR en un model preclínic de ratolí d'ictus isquèmic. Es va utilitzar un model de ratolí d'isquèmia cerebral focal transitòria mitjançant la compressió de l'artèria cerebral mitja (tMCAO) durant 60 minuts. Els animals es van classificar en: Ictus (tMCAo), Ictus+PerCIR (CIR durant tMCAo) i Ictus+PostCIR (CIR 10 minuts després de tMCAo). El CIR constava de 3 cicles de 5 minuts d'isquèmia i 5 minuts de reperfusió en l'extremitat posterior dreta. Setanta-dues hores després de la reperfusió, es va analitzar el volum de l'infart, la funció neurològica i es va realitzar un examen histològic. A més, es va utilitzar una estratègia in vivo per danyar la funció microglial mitjançant un inhibidor del receptor CSF1R. També es van analitzar múltiples citoquines inflamatòries a la sang perifèrica mitjançant un sistema multiplex. La resposta metabòlica específica del CIR es va estudiar en mostres de plasma i de teixit cerebral mitjançant metabolòmica no dirigida basada en LC-MS juntament amb anàlisis univariants i multivariants. Finalment, es va utilitzar la tècnica de microscòpia LSFM per determinar els efectes del CIR a la vasculatura cerebral.

El PerCIR i el PostCIR van reduir significativament la mida de l'infart, van millorar la funció neurològica i van mostrar un patró cel·lular específic i un perfil morfològic a la regió adjacent a l’infart, conduint a la tolerància isquèmica. A més, cada estratègia de CIR va mostrar un perfil específic de citoquines depenent del temps, un perfil metabòlic i va afectar la vasculatura cerebral i la neurogènesi. En conclusió, els nostres resultats van suggerir que el PerCIR i el PostCIR es podrien utilitzar com a noves estratègies neuroprotectores per fer front a lesions isquèmiques. Ambdues estratègies van mostrar diferents vies de senyalització. El PerCIR i el PostCIR van ser teràpies segures, factibles, econòmiques i clínicament rellevants per als pacients amb ictus isquèmic. Aquesta tesi doctoral contribueix a una millor comprensió de l'efecte del CIR després de la isquèmia cerebral.

El ictus isquémico es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en adultos en todo el mundo. Las principales terapias de revascularización son la trombolisis endovenosa y la trombectomía mecánica. Lamentablemente, muchos pacientes no pueden beneficiarse de estas terapias debido a una ventana terapéutica estrecha o a contraindicaciones médicas. Las terapias neuroprotectoras tienen un gran potencial no sólo para aumentar los beneficios de las terapias de reperfusión disponibles, sino también para proporcionar un procedimiento médico aconsejable para los pacientes con ictus isquémico que no son elegibles para los tratamientos actuales. Un enfoque terapéutico prometedor es el condicionamiento isquémico remoto (CIR). El CIR consiste en la aplicación de breves ciclos de isquémia-reperfusión en un órgano distante, como la extremidad, que pueden proporcionar protección al cerebro isquémico. Los efectos protectores del CIR pueden estar mediados por mecanismos celulares que contrarrestan numerosos aspectos de la patogénesis del ictus. Sin embargo, los mecanismos subyacentes específicos que contribuyen a la CIR son complejos y poco conocidos.

En esta tesis doctoral, planteamos la hipótesis de que el efecto neuroprotector inducido por PerCIR (durante la isquemia) y PostCIR (después de la isquemia) en la isquemia cerebral puede estar asociado a un patrón celular específico, a la regulación de la respuesta inflamatoria y a cambios en el perfil metabolómico cerebral. Por lo tanto, el objetivo de este estudio es evaluar los efectos neuroprotectores del PerCIR y PostCIR en un modelo preclínico de ratón de ictus isquémico. Se utilizó un modelo de ratón de isquemia cerebral focal transitoria mediante compresión de la arteria cerebral media (tMCAo) durante 60 minutos. Los animales se clasificaron en: Ictus (tMCAo), Ictus+PerCIR (CIR durante la tMCAo) y Ictus+PostCIR (CIR 10 min después de la tMCAo). El CIR consistió en 3 ciclos de 5 minutos de isquemia y 5 minutos de reperfusión de la extremidad posterior derecha. Setenta y dos horas después de la reperfusión, se analizó el volumen del infarto, la función neurológica y se realizó un examen histológico. Además, se utilizó una estrategia in vivo para alterar la función microglial mediante un inhibidor del receptor CSF1R. También se analizaron múltiples citoquinas inflamatorias en la sangre periférica mediante un sistema multiplex. La respuesta metabólica específica del CIR se evaluó en plasma y tejido cerebral mediante metabolómica no dirigida basada en LC-MS junto a análisis univariados y multivariados. Por último, se utilizó la técnica de LSFM para determinar los efectos del CIR en la vasculatura cerebral.

El PerCIR y el PostCIR redujeron significativamente el tamaño del infarto, mejoraron la función neurológica y mostraron un patrón celular y un perfil morfológico específicos en la región adyacente al infarto, lo que en última instancia condujo a la tolerancia a la isquemia cerebral. Además, cada estrategia de CIR mostró un perfil específico de citoquinas dependiente del tiempo, un perfil metabólico y afectó a la vasculatura cerebral y a la neurogénesis. En conclusión, nuestros resultados sugirieron que el PerCIR y el PostCIR se podrían utilizar como una estrategia neuroprotectora novedosa contra la lesión por isquemia. Ambas estrategias mostraron un papel neuroprotector pero con vías de señalización distintas. El PerCIR y el PostCIR fueron terapias seguras, factibles, baratas y clínicamente relevantes para pacientes con ictus isquémico. Esta tesis doctoral contribuye a una mejor comprensión del efecto del CIR tras la isquemia cerebral.

Acute ischemic stroke (AIS) is one of the leading causes of morbidity and mortality in adult people worldwide. The main revascularization therapies for AIS are thrombolysis with recombinant tissue-plasminogen activator (tPA) and endovascular thrombectomy. Unfortunately, many patients cannot benefit from those therapies due to a narrow therapeutic window or medical contraindications. The development of novel therapeutic strategies is needed to extend therapeutic windows and mitigate further brain injury. Neuroprotective therapies have a great potential to not only increase the benefits of available reperfusion therapies but also to provide an advisable medical procedure for AIS patients who are not eligible for current treatments. A promising therapeutic approach, but insufficient travelled avenue, is the remote ischemic conditioning (RIC). RIC consists of brief episodes of I/R in a distant organ, such as the limb, that can provide protection to the ischemic brain. The protective effects of RIC may be mediated by cellular mechanisms that counteract numerous aspects of stroke pathogenesis. However, the specific underlying mechanisms contributing to RIC are complex and remain poorly understood.

In this doctoral thesis, we hypothesized that the neuroprotective effect induced by RIPerC (during ischemia) and RIPostC (after ischemia) in brain ischemia may be associated with a specific cellular pattern, and the regulation of the inflammatory response and changes in the brain metabolomic profile. Therefore, the aim of this study is to evaluate the neuroprotective effects of RIPerC and RIPostC in a preclinical mouse model of acute ischemic stroke. For that, a mouse model of transient focal cerebral ischemia by compressing the distal middle cerebral artery (tMCAO) for 60 minutes was used. Animals were classified into: Stroke group (tMCAo), Stroke+RIPerC group (RIC during tMCAo) and Stroke+RIPostC group (RIC 10 min after tMCAo). RIC consisted of 3 x 5 min cycles of right hind limb ischemia. Seventy-two hours after reperfusion, infarct volume, functional neurological score and a histological examination were analysed. In addition, an in vivo strategy to impair microglial function by targeting the CSF1R receptor was used. Multiple inflammatory cytokines in the peripheral blood were also measured using a multiplex assay. The RIC-specific metabolic response was assessed in plasma and brain tissue using non-targeted liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) metabolomics coupled with univariate and multivariate analysis. Finally, the light-sheet fluorescence microscopy technique was used to determine the effects of RIC on the microvascular network.

RIPerC and RIPostC significantly reduced the infarction size, improved neurological function and showed a specific cellular pattern and morphological profile in the peri-infarct region, ultimately leading to cerebral ischemia tolerance. Moreover, each RIC strategy showed a specific time-dependent cytokine profile, a metabolic profile and affected the brain vasculature and neurogenesis.

In conclusion, our results suggested that RIPerC and RIPostC would be used as a novel neuroprotective strategy against ischemia injury. Both strategies showed neuroprotective role but distinct signalling pathways. RIPerC and RIPostC were safe, feasible, inexpensive and clinically relevant therapies for AIS patients. This doctoral thesis contributes to a better understanding of the RIC effect after brain ischemia.