Addressing Grand Challenges in Rice Productivity and Sustainability through Biotechnology

Abstract

Aquesta tesis doctoral està enfocada en donar resposta als grans desafiaments de l’agricultura contemporània, concretament la productivitat i la sostenibilitat del cultivo de l’arròs mitjançant l’aplicació de tècniques biotecnològiques com l’enginyeria genètica. Els objectius generales d’aquesta tesis han estat (a) introduir una via de fixació de nitrogeno heteròloga en arròs per a que aquest sigui capaç de fixar el nitrogen biològic i (b) introduir una via ectòpica de captació d’oxigen per a reduir la fotorespiració i millorar la eficiència fotosintètica de les plantes de arròs. Tots dos objectius son congruents amb la millora de la productivitat i la sostenibilitat de l’arròs d’una forma duradora i respectuosa amb el medi ambient i son coherents amb els principals Objectius de Desenvolupament Sostenible, tal com s’articula en la carta de las Nacions Unides sobre el medi ambient. La fixació de nitrogen biològica esta catalitzada por l’enzim nitrogenasa. Aquest enzim està lligat al complex ferro-molibdè (MoFe), denominada proteïna NifDK i a la ferritina, essent denominada proteïna NifH. La proteïna NifB sintetitza precursors del cofactor del lloc actiu de la nitrogenasa (FeMo-co) que s’uneix al nitrogen reduint-lo. En aquesta tesis doctoral he regenerat plantes d’arròs transgèniques que expressen dues formes diferents de la proteïna NifB, prevenients de les arqueobacteries Methanocaldococcus infernus i Methanothermobacter thermautotrophicus. Aquestes proteïnes han estat combinades amb FdxN de Azotobacter vinelandii; NifH de A. vinelandii juntament amb NifM, NifS i NifU de A. vinelandii; i NifH de Hydrogenobacter thermophilus amb NifM de A. vinelandii; a més a més de tres variants de NifD A (NifDAv-Y99K, NifDAv-Y99Q, NifDAv-Y99QY100T) en experiments detallats en cada capítol. Els resultats que he obtingut han estat que ambdues proteïnes NifB i NifH s’acumulen en forma de proteïna soluble in planta. Les proteïnes NifB purificades son funcionals en l’assaig in vitro de síntesis de FeMo-co. La proteïna NifH de H. thermophilus és capaç de desenvolupar els papers fonamentals que las proteïnes complexades a Fe requereixen per a la funcionalitat de la fixació de nitrogen, inclosa la transferència de electrons a la proteïna MoFe component de la nitrogenasa i per a la biosíntesis de FeMo-co. Les tres variants NifDAv han demostrat ser susceptibles de talls per la peptidasa de processat mitocondrial, resultant únicament en la formació de proteïnes truncades. Estudis posteriors cal que s’enfoquin en elucidar el perquè de la inestabilitat de la proteïna i de cóm produir NifD intacta en arròs. La expressió de components biològicament actius de nitrogenasa en arròs transgènic representa un pas crític cap a aconseguir la fixació de nitrogen biològic in planta i quest representa l’únic informe fins ara que ha aconseguit la regeneració d’un cultivo majoritari amb la presencia de components enzimàtics de la nitrogenasa. La fotorespiració redueix l’eficiència fotosintètica perquè resulta a fins un 50% de pèrdua del carbó fixat durant la fotosíntesis. En conseqüència, la reducció de la fotorespiració pot ser una estratègia potencial per a incrementar l’eficiència fotosintètica. En aquesta tesis doctoral he co-introduit l’enzim lactat oxidasa de Lactobacillus buchneri (LbLOX), l’enzim lactat deshidrogenasa de Escherichia coli (EcLDH) i l’enzim catalasa de Oryza sativa (OsCAT) en arròs, establint una nova ruta de captació de oxigen per a reduir la fotorespiració. La co-expressió dels tres gens va ser confirmada a nivell de ARNm. Però solament l’acumulació de la proteïna EcLDH va ser detectable a nivell de teixit de call i en les plantes regenerades. La detecció de l’acumulació de les proteïnes LbLOX i OsCAT va ser probablement interferida por la tag-detectora de proteïnes utilitzada en l’experiment. S’utilitzarà anàlisis d’activitat enzimàtica per a confirmar l’acumulació de proteïnes en tots dos casos i potser és substitueixin les tags-detectores de proteïnes utilitzades.

Esta tesis doctoral está enfocada en dar respuesta a los grandes desafíos de la agricultura contemporánea, concretamente la productividad y la sostenibilidad del cultivo del arroz mediante la aplicación de técnicas biotecnológicas como la ingeniería genética. Los objetivos generales de esta tesis han sido (a) introducir una vía de fijación de nitrógeno heteróloga en arroz para que este sea capaz de fijar el nitrógeno biológico e (b) introducir una vía ectópica de captación de oxígeno para reducir la fotorespiración y mejorar la eficiencia fotosintética de las plantas de arroz. Ambos objetivos son congruentes con la mejora de la productividad y la sostenibilidad del arroz de una manera duradera y respetuosa con el medio ambiente y son coherentes con los principales Objetivos de Desarrollo Sostenible, tal como se articula en la carta de las Naciones Unidas sobre el medio ambiente. La fijación de nitrógeno biología esta catalizada por la enzima nitrogenasa. Esta enzima está ligada al complejo hierro-molibdeno (MoFe), denominado proteína NifDK y a la ferritina, siendo denominado proteína NifH. La proteína NifB sintetiza precursores del cofactor del lugar activo de la nitrogenasa (FeMo-co) que se une al nitrógeno reduciéndolo. En esta tesis doctoral he regenerado plantas de arroz transgénicas que expresan dos formas diferentes de la proteína NifB, provenientes de las arqueobacterias Methanocaldococcus infernus y Methanothermobacter thermautotrophicus. Estas proteínas han sido combinadas con FdxN de Azotobacter vinelandii; NifH de A. vinelandii juntamente con NifM, NifS y NifU de A. vinelandii; y NifH de Hydrogenobacter thermophilus con NifM de A. vinelandii; además de tres variantes de NifD A (NifDAv-Y99K, NifDAv-Y99Q, NifDAv-Y99QY100T) en experimentos detallados en cada capítulo. Los resultados que he obtenido han sido que ambas proteínas NifB y NifH se acumulan en forma de proteína soluble in planta. Las proteínas NifB purificadas son funcionales en el ensayo in vitro de síntesis de FeMo-co. La proteína NifH de H. thermophilus es capaz de desarrollar los papeles fundamentales que las proteínas complejadas a Fe requieren para la funcionalidad de la fijación de nitrógeno, incluida la transferencia de electrones a la proteína MoFe componente de la nitrogenasa y para la biosíntesis de FeMo-co. Las tres variantes NifDAv han demostrado ser susceptibles de cortes por la peptidasa de procesado mitocondrial, resultando solo en la formación de proteínas truncadas. Estudios posteriores se tienen que enfocar en elucidar el porqué de la inestabilidad de la proteína y de cómo producir NifD intacta en arroz. La expresión de componentes biológicamente activos de nitrogenasa en arroz transgénico representa un paso criticó hacia conseguir la fijación de nitrógeno biológico in planta y representa el único informe hasta ahora que ha conseguido la regeneración de un cultivo mayoritario con la presencia de componentes enzimáticos de la nitrogenasa. La fotorespiración reduce la eficiencia fotosintética porque resulta en hasta un 50% de pérdida del carbón fijado durante la fotosíntesis. En consecuencia, la reducción de la fotorespiración puede ser una estrategia potencial para incrementar la eficiencia fotosintética. En esta tesis doctoral he co-introducido la enzima lactato oxidasa de Lactobacillus buchneri (LbLOX), la enzima lactato deshidrogenasa de Escherichia coli (EcLDH) y la catalasa de Oryza sativa (OsCAT) en arroz, estableciendo una nueva ruta de captación de oxígeno para reducir la fotorespiración. La co-expresión de los tres genes fue confirmada a nivel de ARNm. Pero solamente la acumulación de la proteína EcLDH fue detectable a nivel de tejido de callo y en las plantas regeneradas. La detección de la acumulación de las proteínas LbLOX y OsCAT fue probablemente interferida por la tag-detectora de proteínas utilizada en el experimento. Se utilizarán análisis de actividad enzimática para confirmar la acumulación de proteínas en ambos casos y quizás se reemplacen las tags-detectoras de proteínas utilizadas.

This thesis focuses on addressing the grand challenges of contemporary agriculture in rice productivity and sustainability through biotechnology. The overall aims of my thesis were to (a) engineer a heterologous biological nitrogen fixation pathway to incorporate biological nitrogen fixation in rice and (b) engineer an ectopic oxygen scavenging pathway to reduce photorespiration and improve photosynthetic efficiency. Both objectives are congruent with improving rice productivity and sustainability in a durable and environmentally friendly manner and are consistent with key major Sustainability Development Goals as articulated by the UN charter on the environment. Biological nitrogen fixation is catalyzed by nitrogenase. This enzyme is composed of molybdenum-iron (MoFe) protein (NifDK) and Fe protein (NifH). NifB synthesizes precursors of the nitrogenase active site cofactor (FeMo-co) that binds to nitrogen and reduces it. I generated transgenic rice plants expressing two different forms of NifB from the archaean Methanocaldococcus infernus and Methanothermobacter thermautotrophicus, together with Azotobacter vinelandii FdxN; NifH from A. vinelandii together with A. vinelandii NifM, NifS and NifU; NifH from Hydrogenobacter thermophilus with A. vinelandii NifM; and three A. vinelandii NifD variants (NifDAv-Y99K, NifDAv-Y99Q, NifDAv-Y99QY100T) in separate sets of experiments as detailed in the subsequent chapter of the thesis. I determined that both NifB and NifH proteins accumulated as soluble proteins in planta. The purified NifB proteins were functional in the in vitro FeMo-co synthesis assay. Purified H. thermophilus NifH proteins were able to carry out the fundamental roles of the Fe protein required to engineer nitrogen fixation, including electron transfer to the nitrogenase component MoFe protein and the biosynthesis of FeMo-co. The three NifDAv variants were susceptible to cleavage by mitochondrial processing peptidase, resulting in the formation of only truncated proteins. Further studies need to focus on understanding the basis of this instability and producing intact NifD in rice. The expression of biologically active nitrogenase components in transgenic rice represents a critical step toward achieving biological nitrogen fixation in planta and represents the only report to date which resulted in the recovery of a stably transformed major crop expressing nitrogenase component enzymes. Photorespiration reduces overall photosynthetic efficiency because it results in up to 50% loss of carbon fixed by photosynthesis. Reducing photorespiration, therefore, is a potential strategy to increase photosynthetic efficiency. I co-introduced Lactobacillus buchneri lactate oxidase (LbLOX), Escherichia coli lactate dehydrogenase (EcLDH) and Oryza sativa catalase (OsCAT) into rice to establish a novel oxygen scavenging pathway to reduce photorespiration. Expression of the three transgenes was confirmed at mRNA levels. Only EcLDH protein accumulation was detectable in callus and regenerated plants. Detection of LbLOX and OsCAT protein accumulation was probably hampered by the detection tag used to identify the protein. Further experiments will be required to confirm the accumulation of both proteins by enzymatic assays and the replacement of the assay tags.